《Cell Reports Methods》：Mycobacterium tuberculosis gene expression dynamics in host environments with single-cell resolution
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可视化结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）基因在宿主细胞中何时与何处表达，对于理解结核病（tuberculosis，TB）异质性至关重要。然而，研究Mtb时空基因表达的成像方法仍然有限。在此，研究人员开发了一种双荧光团M
可视化结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）基因在宿主细胞中何时与何处表达，对于理解结核病（tuberculosis，TB）异质性至关重要。然而，研究Mtb时空基因表达的成像方法仍然有限。在此，研究人员开发了一种双荧光团Mtb报告系统，能够以高空间和时间分辨率对Mtb基因表达进行高内涵活细胞成像。通过监测Mtb ESX-1分泌系统组分，研究人员观察到感染的人巨噬细胞内部及不同巨噬细胞之间Mtb启动子活性存在显著异质性。研究人员进一步发现，phthiocerol dimycocerosates（PDIM）缺陷以及巨噬细胞中ATG14（autophagy-related 14）缺失改变了ESX-1组分的启动子活性。与该异质性的动态性质一致，espA启动子活性在吞噬作用后随时间变化，突显了时间调控。将观察扩展至体内，研究人员在C3HeB/FeJ小鼠模型中证实了ESX-1启动子活性异质性。总之，研究人员的发现揭示了Mtb基因表达动态在体外和体内未被充分认识的异质性。
结核病（tuberculosis，TB）由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起，Mtb是一种主要感染肺巨噬细胞的胞内细菌。感染宿主细胞后，Mtb动态定位于具有不同生化特征的亚细胞生态位。既往通过整体双RNA测序和蛋白质组学鉴定了感染期间宿主和病原体基因表达谱，但这些基于群体的策略无法精细定义感染期间基因表达的空间与时间分辨率。人结核病灶高度异质，包含表型不同的细菌群体；Mtb表型异质性有利于生存和耐受抗生素。因此需要创新方法捕捉表型异质性。荧光蛋白报告已用于可视化细菌基因表达，但仍难以在单细胞水平解析七型分泌系统（type VII secretion system，T7SS）尤其是ESX-1的时空表达。Mtb编码ESX-1至ESX-5五个T7SS；ESX-1位于差异区1（region of difference 1，RD1），编码EsxA（Rv3875）/EsxB（Rv3874）等，并受espACD簇调控。尽管ESX-1对毒力重要，其在感染中何时何地表达仍不清楚。为此研究人员设计并验证基于荧光报告的策略，成像和定量感染期间Mtb ESX-1启动子动态，以研究TB异质性。
关键技术方法：研究人员构建质粒编码双荧光报告系统：组成型msp12驱动稳定E2-Crimson，候选启动子驱动稳定mWasabi或不稳定mWasabi-LVA，电转化Mtb H37Rv。使用人iPSC来源巨噬细胞（human induced pluripotent stem cell-derived macrophages，iPSDMs；KOLF2/HPSI0114i-kolf_2，来自Public Health England Culture Collections，目录号77650100）及THP-1、RAW264.7感染，结合活/固定共聚焦、高内涵、TrackMate和Fiji/3D分割。构建phthiocerol dimycocerosates（PDIM）缺陷株Mtb Δppse与ATG14
?/?巨噬细胞。C3HeB/FeJ小鼠（原购自Jackson Labs，室内繁育）低剂量气溶胶感染，28 d后肺组织3D成像。
研究结果：
1. 单细胞水平可视化胞内Mtb启动子活性的双报告系统设计。通过构建两个系统，稳定mWasabi用于固定/活细胞单菌或对象水平分析；不稳定mWasabi-LVA经Tet-off验证，aTc处理后约2 h开始降解、4 h几乎完全降解，适合动态转录追踪。感染人巨噬细胞后活/固定共聚焦可分析候选启动子。
2. 胞内Mtb ESX-1组分表达异质。通过esxA、espA、PE35稳定报告株感染iPSDMs 2、24、48 h，固定成像并量化超过4,000细菌对象/株/时间点，发现感染巨噬细胞间和单个巨噬细胞内Mtb对象启动子活性显著异质；esxA和PE35群体水平无显著差异，PE35活性较低且变化小；espA随感染进展群体水平升高，显示时间调控。
3. 宿主和病原因子影响胞内Mtb ESX-1活性。通过ATG14
?/?与ATG14
+/+巨噬细胞感染WT或PDIM缺陷Mtb Δppse报告株，发现esxA活性在ATG14
?/?中48 h降低，在Δppse中升高；espA在ATG14
?/?中降低，PDIM缺陷未导致esxA样升高；PE35在各条件约2倍且基本不变。BafA1（Bafilomycin A1，巴弗洛霉素A1）处理降低espA活性，不影响esxA和PE35，提示espA对吞噬体酸化敏感。
4. 胞内Mtb启动子活性的时空分辨。通过不稳定mWasabi报告和SPY555-actin标记吞噬，活细胞成像超过12 h，TrackMate追踪超过100感染巨噬细胞，发现espA活性在吞噬后高度异质，存在先升后降、波动、持续升高等不同时间模式。
5. 胞内Mtb ESX-1组分表达与受损区室相关。通过RFP-Galectin-8（Gal8，半乳糖凝集素8）THP-1巨噬细胞感染，6 h固定分析，发现高espA和高esxA活性的细菌对象更常与RFP-Gal8阳性区室相关，提示高启动子活性与含菌区室损伤状态相关。
6. 体内胞内Mtb ESX-1组分表达异质。通过C3HeB/FeJ小鼠气溶胶感染，肺组织3D成像，稳定esxA报告在多数对象可检测，去稳定esxA仅在子集检测；稳定espA可检测，去稳定espA显示对象级异质。结论：ESX-1启动子活性可在体内量化且异质。
讨论与结论：讨论指出稳定报告时间分辨率有限，去稳定EGFP、dsRed、pTimer等已有，而本研究用稳定/不稳定mWasabi。聚焦ESX-1因其毒力核心且胞内表达动态了解有限。异质性可源于不对称分裂、局部环境压力和宿主免疫压力。流式可提高通量但丢失空间信息。esxA和PE35虽在RD1，但人巨噬细胞感染中群体水平未升高，与msp12相关提示早期稳定；与CDC1551长期感染差异可能因菌株、宿主细胞、感染时长、检测类型或调控序列。espA逐渐升高且BafA1降低，提示对酸性吞噬体环境敏感。PDIM缺陷增加esxA，ATG14缺失降低esxA/espA，Gal8关联；PE35稳定，提示ESX-1相关基因不一定共转录调控。局限包括启动子长度未系统变化、报告为游离质粒、多拷贝可能放大输出并影响生理，以及图像分析不能总分辨单菌，对象可能是单菌或未分辨菌簇。研究结论翻译：总之，研究人员的发现揭示了Mtb基因表达动态在体外和体内未被充分认识的异质性。该研究提供监测Mtb时空异质性的工具，对理解TB发病、持续和播散具有重要意义。
