《Antibodies》：Targeting the Complement C1 Proteases Using Camelid-Derived Single Domain Antibodies: Production, Characterization and Possible Application for Tissue/Fluid Analysis
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背景。补体C1r和C1s蛋白酶在C1复合物内启动经典补体通路，但新近证据提示它们在组织中还存在额外功能，包括与癌症和结缔组织疾病相关的细胞内在功能。目前用于探索这些血浆和组织相关功能的工具很少。研究人员报道了抗C1r和抗C1s VHH单域抗体（纳米抗体）的首次
背景。补体C1r和C1s蛋白酶在C1复合物内启动经典补体通路，但新近证据提示它们在组织中还存在额外功能，包括与癌症和结缔组织疾病相关的细胞内在功能。目前用于探索这些血浆和组织相关功能的工具很少。研究人员报道了抗C1r和抗C1s VHH单域抗体（纳米抗体）的首次开发与表征。方法。用纯化的人C1r2/C1s2四聚体免疫一头美洲驼。经噬菌体展示筛选后，在E. coli中生产了两株抗C1r VHH（C1rCl1、C1rCl6）和一株抗C1s VHH（C1sCl7），并通过ELISA、Western blot、SPR和体积排阻色谱，使用重组蛋白酶片段和前酶形式对其进行了表征。通过切割实验评估了对C1s激活的功能影响，并通过人皮肤切片的免疫组织化学评估了组织适用性。结果。所有三株VHH均以高亲和力结合活性形式和前酶形式。表位定位将C1rCl1和C1rCl6定位于C1r的CCP2模块，将C1sCl7定位于C1s的CCP1模块。两株抗C1r VHH识别不同且不重叠的表位，可同时结合C1r。C1rCl1轻度抑制C1r对C1s的激活。VHH对C1rCl1/C1rCl6能够在血清、血浆和细胞培养上清中通过夹心ELISA检测C1r。人皮肤免疫组织化学证实角质形成细胞和成纤维细胞中C1r染色清晰，且与C1s相比呈现解离的组织分布。结论。这些首批抗C1r和抗C1s纳米抗体构成用于生物体液检测和组织染色的有用工具，在这些蛋白酶发挥病理作用的疾病中具有潜在应用价值。
补体C1r与C1s蛋白酶纳米抗体工具的开发与表征：研究解读
一、研究背景与问题
补体C1r和C1s蛋白酶是经典补体通路的关键起始蛋白酶，在循环中与C1q结合形成C1复合物，介导免疫复合物识别后的级联激活。然而，近年研究揭示这两种蛋白酶在组织和细胞内部还存在独立于C1复合物的新功能，涉及癌症进展、结缔组织疾病和自身免疫等病理过程。例如，C1r在肾纤维化中发挥作用，肿瘤细胞分泌的C1r通过上调ITGB1介导的Akt/Erk信号和抑制Fas/FasL凋亡通路促进转移和失巢凋亡抵抗；细胞内C1s则调节肿瘤细胞增殖及其与肿瘤浸润T细胞的交互。在皮肤鳞状细胞癌和口腔鳞状细胞癌中，C1r和C1s的高表达与不良预后相关，而在三阴性乳腺癌中则与较好预后相关，这取决于细胞内在的趋化因子分泌调控和细胞毒性T细胞募集。
尽管这些蛋白酶的生物学意义日益扩展，研究领域却缺乏有效的分子工具来区分C1r和C1s的各自贡献、定位其组织分布并探究其细胞内功能。传统多克隆抗体特异性有限，且尚无靶向C1r或C1s的单域抗体被报道。因此，开发高亲和力、高特异性的检测工具成为该领域的迫切需求。
二、研究内容与主要结论
研究人员采用人血浆纯化的(C1r)2/(C1s)2四聚体免疫美洲驼，通过噬菌体展示技术筛选获得抗C1r和抗C1s的VHH单域抗体（纳米抗体）。经表征，获得两株抗C1r VHH（C1rCl1、C1rCl6）和一株抗C1s VHH（C1sCl7），均以高亲和力结合C1r或C1s的活性形式和前酶形式。表位定位显示C1rCl1和C1rCl6靶向C1r的CCP2模块，C1sCl7靶向C1s的CCP1模块。两株抗C1r VHH识别不同且不重叠的表位，可同时结合C1r形成三元复合物。功能实验表明C1rCl1在饱和浓度下可轻度抑制C1r对C1s的激活切割。基于C1rCl1捕获和C1rCl6-Fc检测的夹心ELISA成功在血清、血浆和细胞培养上清中检测到C1r。人皮肤免疫组织化学证实C1r在角质形成细胞和成纤维细胞中清晰染色，而C1s染色较弱，且汗腺中仅检测到C1r，表明两种蛋白酶在组织中的分布较循环中更为解离。
三、主要关键技术方法
研究人员采用以下关键技术方法开展研究：用纯化的人C1r2/C1s2四聚体免疫美洲驼，构建VHH噬菌体展示文库并进行两轮淘选；在E. coli中表达纯化VHH；利用血浆纯化的活性C1r/C1s、重组前酶形式（活性位点丝氨酸突变为丙氨酸的SA突变体）及系列重组片段进行ELISA、Western blot、表面等离子体共振（SPR）和体积排阻色谱（SEC）表征；通过切割实验评估VHH对C1s激活的影响；使用人皮肤FFPE切片进行免疫组织化学验证组织适用性。
四、研究结果
4.1 美洲驼免疫
以人血浆纯化的(C1r)2/(C1s)2四聚体为抗原，对一头美洲驼进行三次免疫注射，ELISA证实免疫成功，同时获得了针对人C1r和C1s的VHH。
4.2 用于表位定位的蛋白制备
研究人员制备了包含前酶形式和活性形式的全套C1r和C1s蛋白及片段，包括血浆C1r、血浆C1s、重组前酶四聚体(rC1r SA Strep)2/(rC1s SA Flag)2、rC1r CCP1-2 SP Strep、rC1r CCP2 SP Strep、rC1s CCP1-2 SP Strep和rC1s CEC CCP1 His等，所有蛋白均成功表达纯化。
4.3 VHH纯化与初步表征
所有VHH均高效生产，平均产量15 mg/L培养物，纯度较高。ELISA和Western blot分析表明，C1rCl1和C1rCl6识别所有C1r蛋白变体，不区分片段、前酶和活性形式；C1rCl6在高浓度下对C1s存在部分交叉反应。C1sCl7特异性识别C1s的活性形式和前酶形式，对C1r和同源酶MASP-2均无交叉反应。
4.4 抗C1r VHH的不同表位与亲和力参数
SPR分析显示C1rCl6对血浆C1r和rC1r CCP1-2 SP的亲和力（KD 0.23-0.35 nM）约为C1rCl1（KD 1.2-1.3 nM）的4-5倍，对rC1r CCP2 SP片段的亲和力差异近10倍。SEC和SPR实验证实两株抗C1r VHH结合不同表位，可同时结合C1r的CCP2 SP区域形成三元复合物。
4.5 VHH的潜在抑制效应
切割实验表明，C1rCl1在2:1摩尔比时降低rC1s SA的激活切割，且需达到阈值浓度，提示需饱和C1r的所有结合位点；C1rCl6和C1sCl7对切割无影响，与C1sCl7靶向CCP1模块、不干扰SP模块内切割的定位一致。
4.6 生物体液中的C1r检测
以C1rCl1为捕获抗体、C1rCl6-Fc为检测抗体的夹心ELISA，可在血清（需添加5 mM EDTA）、EDTA血浆和转染细胞培养上清中检测到C1r，而在C1r耗竭血清中无信号。
4.7 组织染色应用
人皮肤免疫组织化学显示，C1rCl1和C1sCl7 VHH的染色结果与商品化兔多克隆抗体一致且背景干净。C1r在角质形成细胞和成纤维细胞中强阳性染色，C1s染色较弱；汗腺中仅检测到C1r阳性染色，表明两种蛋白酶在组织中的分布较循环中更为解离。
五、讨论与结论
研究人员指出，采用C1r2-C1s2四聚体免疫策略可能产生针对两种同源蛋白酶（序列一致性36.7%）的交叉反应性VHH，C1rCl6的交叉反应即为例证。所有VHH均不能区分活性形式和前酶形式，这与表位位于CCP模块、而构象变化仅发生在SP模块活性位点附近的观察一致。C1rCl1对C1s激活的轻度抑制效应提示其具有进一步工程化改造为更强抑制剂的潜力，可通过多拷贝融合或人IgG Fc融合等策略增强。VHH在还原和非还原条件下均适用于Western blot，优于通常仅识别还原形式的商品化抗体。夹心ELISA中血清样本需添加EDTA解离C1复合物才能检测C1r，提示循环中C1r几乎完全与C1s和C1q结合。组织染色结果证实C1r和C1s在组织中并非总是共定位，与既往在乳腺癌中的发现一致，且染色模式提示细胞内定位，支持这些蛋白酶在组织中的细胞内在功能。
研究结论：这些首批抗C1r和抗C1s纳米抗体为研究这些蛋白酶在经典循环环境和组织细胞内的功能提供了有前景的工具包。其高亲和力、高特异性以及与夹心ELISA和组织免疫组织化学的兼容性使其可立即用作研究工具。这些纳米抗体有望支持未来在系统性红斑狼疮、牙周Ehlers-Danlos综合征和多种癌症等C1r或C1s发挥明确病理作用的疾病中进行患者随访和组织分析。
