pH响应性多糖水凝胶GOZ6通过时空协调ZIF-8@CaO2氧递送与免疫代谢重塑促进糖尿病骨再生

《Research》：A pH-Responsive Polysaccharide Hydrogel Modulates Oxygen Delivery and Immunometabolic Remodeling for Diabetic Bone Regeneration

糖尿病骨缺损(diabetic bone defects)难以修复，因为慢性缺氧(chronic hypoxia)、氧化应激(oxidative stress)、持续性炎症(persistent inflammation)和骨血管生成偶联(osteoangiogenic coupling)受损破坏愈合级联(healing cascade)。在此，研究人员报道一种pH响应性(pH-responsive)多糖水凝胶(polysaccharide hydrogel)GOZ6，用于时空协调(spatiotemporally coordinated)的糖尿病骨再生。GOZ6由明胶(gelatin)与氧化魔芋葡甘聚糖(oxidized konjac glucomannan)之间的动态席夫碱(Schiff base)交联形成，并共同递送ZIF-8@CaO₂(zeolitic imidazolate framework-8 encapsulated calcium peroxide)和6-姜酚(6-gingerol)，整合门控氧(O₂)释放、钙离子(Ca²⁺)递送、抗氧化保护(antioxidative protection)和免疫调节(immunomodulation)。该水凝胶在约67 s内快速凝胶化，具有孔隙率为75.78%的多孔结构，pH响应性降解，并在生理条件下持续释放O₂长达14 d。在弱酸性条件下，约60%的6-gingerol在前3 d内释放，支持早期抗炎和抗氧化干预。体外(in vitro)，GOZ6维持细胞活力高于90%，促进巨噬细胞(macrophages)向修复性表型(reparative phenotype)极化，抑制促炎细胞因子(pro-inflammatory cytokines)产生，并恢复氧化代谢(oxidative metabolism)。转录组(transcriptomic)和蛋白质(protein)分析发现，JAK1–STAT3(Janus kinase 1–signal transducer and activator of transcription 3)和PI3K–AKT(phosphatidylinositol 3-kinase–protein kinase B)可能是参与这些作用的中心通路。此外，GOZ6条件化免疫微环境(conditioned immune microenvironment)增强内皮迁移(endothelial migration)和管形成(tube formation)，减轻骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)中的氧化应激，恢复线粒体功能(mitochondrial function)，并促进成骨分化(osteogenic differentiation)。在糖尿病大鼠颅骨缺损(calvarial defect)模型中，GOZ6显著增强血管化骨再生(vascularized bone regeneration)、胶原沉积(collagen deposition)和成骨标志物(osteogenic marker)表达，同时减少局部炎症，且无明显全身毒性(systemic toxicity)。因此，GOZ6提供一种多功能策略，将糖尿病骨缺损转化为允许修复的微环境(repair-permissive microenvironment)。

糖尿病骨缺损(diabetic bone defects)修复困难。全球糖尿病流行使骨折风险升高，2型糖尿病(type 2 diabetes)患者骨折风险接近非糖尿病者的3倍，且延迟愈合和骨不连风险增加。糖尿病骨缺损被视为再生失败疾病，其核心病理包括慢性缺氧(chronic hypoxia)、氧化应激(oxidative stress)超载、免疫代谢功能障碍(immunometabolic dysfunction)以及成骨信号崩溃。糖尿病骨损伤微环境pH并非静止：早期炎症阶段，缺氧、糖酵解增强、乳酸积累和炎症细胞浸润可使局部呈弱酸性，常以约pH 6.5模拟；炎症消退和血管灌注改善后逐渐回到生理pH。这种酸性到生理pH转变是设计GOZ6作为pH响应性注射水凝胶的重要病理基础。传统内固定、骨移植、生长因子、离子释放支架、细胞治疗、免疫调节或抗氧化策略多只能针对单一环节，难以同时纠正缺氧、炎症、氧化应激、血管再生不足和成骨-血管偶联障碍。未受控的过氧化钙(CaO₂)暴露还可能产生H₂O₂骤增和局部pH扰动。因此，研究人员构建GOZ6，以时空协调方式调控糖尿病骨再生微环境。该研究发表在《Research》。

关键技术方法简要概括：研究人员以氧化魔芋葡甘聚糖与明胶经动态席夫碱(Schiff base)交联制备注射水凝胶，共载ZIF-8@CaO₂与6-姜酚(6-gingerol)。材料学采用SEM/TEM、EDS、DLS、XPS、FTIR、XRD、汞压入孔隙率、流变、压缩、湿粘附、HPLC和溶解氧测定。体外以高糖联合LPS刺激RAW264.7巨噬细胞，并结合BMSCs与HUVECs，采用条件培养基、Transwell共培养、划痕、管形成、免疫荧光、流式、Western blot、ELISA、RT-qPCR、RNA-seq、分子对接及CRISPR-Cas9敲除JAK1/STAT3。体内采用6周龄雄性Sprague–Dawley大鼠，高脂饮食4周后连续3 d腹腔注射STZ 30 mg/kg，空腹血糖持续>16.7 mM，建立双侧5 mm颅骨缺损，分组为Blank control、GO、GOZ、GO6、GOZ6，并于4和8周行micro-CT、H&E、Masson及免疫组化，另取心、肝、脾、肺、肾行H&E评估生物安全性。

研究结果如下。

ZIF-8封装过氧化钙纳米颗粒的制备与表征：通过SEM、TEM、EDS、DLS、XPS、FTIR和XRD表征，CaO₂被复合入ZIF-8，ZIF-8@CaO₂粒径由ZIF-8约149 nm增至约486 nm，并保留两组分特征衍射峰。ZIF-8在pH 6.5下降解快于pH 7.4，第7天约20%初始质量剩余。复合颗粒在弱酸性条件下持续氧释放约8 d，在生理条件下延长至约14 d，说明ZIF-8包覆调控了氧释放动力学。

GOZ6水凝胶的制备与理化表征：FTIR证实魔芋葡甘聚糖成功氧化；GOZ6约67 s发生溶胶-凝胶转变。SEM和汞压入孔隙率显示水凝胶具有多孔结构，GOZ6孔隙率为75.7839%，Zn和Ca信号广泛分布。弱酸性条件下，6-gingerol在前3 d快速释放；XPS和二维相关FTIR支持席夫碱形成及氢键相互作用。GOZ6呈pH响应性降解，弱酸条件约14 d几乎完全降解；复合纳米颗粒增强力学性能，GOZ和GOZ6湿骨粘附强度较高；GOZ6氧生成最缓慢且持续。

GOZ6水凝胶的细胞相容性：Live/Dead染色和CCK-8实验显示，BMSCs和RAW264.7细胞在各组中活力均高于90%，GOZ6组增殖表现最佳，提示良好细胞相容性。

GOZ6调节巨噬细胞极化并改善代谢状态：免疫荧光、流式、Western blot、ELISA和RT-qPCR显示，GOZ6降低M1标志CD86，升高M2标志CD206，上调Arg1、CD206、Fizz1、Ym1，降低TNF-α、IL-12、IFN-γ并升高IL-10，上调Il10、Tgf-β并下调Tnf-α、iNos。GSEA提示氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)相关通路富集，GOZ6组乳酸水平和葡萄糖消耗降低，ATP和线粒体DNA(mtDNA)升高，表明巨噬细胞向修复性表型和氧化代谢状态重编程。

转录组提示GOZ6介导巨噬细胞重编程相关信号通路：RNA-seq和KEGG分析显示GOZ6处理引起广泛转录改变，富集于免疫系统和信号转导。分子对接预测6-gingerol与AKT1、JAK1的结合能分别为?7.4和?8.9 kcal mol^?1，并提示与AKT1的Glu191、His194、Asp292及JAK1的Leu881可能形成氢键；该分析仅用于候选通路筛选。JAK1或STAT3缺失减弱GOZ6诱导的修复性巨噬细胞表型；AKT磷酸化升高，GSK3β和NF-κB p65磷酸化变化，AKT抑制可部分逆转下游变化。GSEA显示氧化磷酸化正富集，NOD样受体信号、TNF信号和脂肪酸生物合成负富集。结果支持JAK1–STAT3和PI3K–AKT相关信号参与GOZ6免疫调节，但不证明6-gingerol直接靶向这些蛋白。

GOZ6处理与内皮血管生成行为增强相关：巨噬细胞-内皮细胞共培养中，GOZ6组HUVEC迁移细胞数最多，管形成网络更完整且总管长最大，CD31荧光最强；Western blot显示RAW264.7中TGF-β和PDGF表达升高。结果提示GOZ6通过材料直接作用和巨噬细胞介导的微环境调控支持内皮血管生成行为。

GOZ6减轻氧化应激、改善线粒体功能并促进BMSCs成骨分化：JC-1染色和流式显示GOZ6组高膜电位细胞比例升高。ROS染色显示GO和GOZ组ROS较高，GO6和GOZ6组明显降低。ALP和ARS染色显示GOZ6组染色最强、矿化面积最大；COL1免疫荧光增强；RT-qPCR显示Alpl、Runx2、Col1a1、Bglap等成骨相关基因上调，表明GOZ6减轻氧化应激、恢复线粒体功能并促进成骨分化。

GOZ6显著促进糖尿病颅骨缺损修复并改善局部免疫-血管-成骨微环境：在糖尿病大鼠颅骨缺损模型中，micro-CT显示GOZ6组新骨形成最多、残余缺损最小，BMD和BV/TV在4和8周均最高。H&E和Masson染色显示GOZ6组组织填充更完整、成熟新骨和胶原沉积更多。免疫组化显示GOZ6降低TNF-α、升高IL-10，并增强COL1A1、CD31和RUNX2表达。心、肝、脾、肺、肾未见明显病理异常，提示良好体内生物安全性。

讨论部分总结：糖尿病骨修复受持续性炎症、氧化应激、缺氧、血管再生不足和代谢紊乱共同影响。直接暴露的CaO₂易快速分解，导致氧暴释、H₂O₂积累和局部碱化；ZIF-8@CaO₂通过pH响应性多孔限域和凝胶网络限制CaO₂暴露，使氧和离子更持续释放。巨噬细胞不仅存在表型变化，也发生代谢重塑；GOZ6同时改变巨噬细胞表型和代谢状态。6-gingerol具有抗氧化和抗炎特性，GOZ6增加IL-10并影响JAK1–STAT3相关信号，同时AKT、GSK3β和p65变化提示PI3K–AKT相关通路参与，但分子对接不证明直接结合。GOZ6在弱酸性条件下优先释放6-gingerol，氧、Zn和Ca释放更持续，但现有数据未建立严格时序机制。成骨障碍不仅是成骨因子不足，还与高氧化压力和低能量状态有关；GOZ6降低氧化应激、改善线粒体膜电位并提高成骨标志物。GOZ6为可注射水凝胶，适应不规则缺损并通过动态席夫碱网络实现pH响应释放；其降解主要考虑酸敏感席夫碱水解，Zn²⁺相关MMP调控仍需验证。研究不足包括未与自体骨或商用磷酸钙移植材料直接比较，长期降解、生物安全性、组分稳定性和6-gingerol直接分子作用尚需研究，制造工艺和质量属性需标准化，并需在大动物负重骨缺损模型中进一步验证。

研究结论翻译：总之，研究人员开发了一种pH响应性多糖水凝胶GOZ6，通过整合ZIF-8@CaO₂介导的氧/钙递送与6-gingerol介导的抗氧化和免疫调节功能，用于糖尿病骨再生。GOZ6表现出快速凝胶化、多孔结构、pH响应性降解、持续氧释放和良好细胞相容性。体外，GOZ6促进修复性巨噬细胞极化，改善巨噬细胞氧化代谢，增强内皮血管生成活性，降低BMSCs中的氧化应激，并促进成骨分化，这些免疫代谢效应与JAK1–STAT3和PI3K–AKT信号相关。体内，GOZ6增强糖尿病颅骨缺损中的血管化骨形成、胶原沉积和成骨标志物表达，同时减少局部炎症并显示良好生物安全性。这些发现提示GOZ6是一种有前景的多功能水凝胶平台，用于重塑糖尿病骨缺损微环境。