Autoinducer-2（AI-2）在 Escherichia coli 中兼具群体感应与代谢信号功能：碳源可利用性经 cAMP–CRP 调控 lsr 操纵子并驱动环境细菌以 AI-2 为唯一碳源

《Applied and Environmental Microbiology》：Autoinducer-2 functions as both a quorum-sensing and metabolic signal in Escherichia coli

　　

细菌整合多种环境信号以协调行为，但营养感应与群体感应（quorum sensing, QS）之间的关系仍未完全阐明。Autoinducer-2（AI-2）在QS信号中具有独特性，其产生与中心代谢紧密相连，这提出了代谢功能与信号功能边界的基本问题。在 Escherichia coli 中，AI-2通过lsr操纵子协调集体行为，该操纵子的表达不仅受AI-2响应型阻遏蛋白LsrR控制，也受cAMP受体蛋白（cAMP receptor protein, CRP）控制，从而将其置于碳源感应与群体水平信号传递的交汇点。虽然此前已证实PTS（phosphotransferase system）糖抑制lsr表达，研究人员表明非PTS糖同样通过CRP抑制lsr表达，进一步使QS激活与细胞密度解耦，并与碳源可利用性耦合。对Enterobacteriaceae的基因组分析显示，lsr启动子中的CRP结合位点广泛保守，表明AI-2信号传导的代谢调制是一种祖先调控特征。利用基于FRET的生物传感器，研究人员进一步表明AI-2输入以类似于非PTS碳转运的方式调节细胞内cAMP水平，提示AI-2最初可能作为营养底物发挥功能。此外，研究人员分离了能够以AI-2为唯一碳源的土壤和叶际相关细菌。有趣的是，这种能力似乎独立于通过LuxS/Lsr通路产生和代谢AI-2的能力而进化。总体而言，研究人员的发现揭示了AI-2 QS被低估的代谢基础，并提示在某些物种中，营养利用与细胞间信号传导可能从共同祖先通路分化而来。

研究背景与问题。细菌在自然复杂环境中持续整合营养、胁迫和QS自诱导物等信号，以调整生理状态。QS使细菌通过产生、释放和检测小信号分子同步群体基因表达，协调生物膜形成、公共物品分泌和毒力因子产生等集体行为。AI-2是系统发育分布最广的QS信号之一，由LuxS产生，并且不是专用信号分子，而是活化甲基循环中S-腺苷同型半胱氨酸解毒产生的副产物。E. coli中AI-2调节自聚集、生物膜形成、哺乳动物肠道定植和种间互作，多数表型由LsrB与Tsr趋化受体介导的AI-2趋化调控。lsr操纵子编码高亲和AI-2 ABC转运器、磷酸化AI-2的LsrK、以及被磷酸化AI-2失活的阻遏蛋白LsrR，形成正反馈。lsr操纵子类似典型碳水化合物利用操纵子，并受LsrR和cAMP–CRP调控，因而受碳分解代谢物阻遏（carbon catabolite repression, CCR）影响。CCR通过磷酸烯醇丙酮酸（phosphoenolpyruvate, PEP）：磷酸转移酶系统（PTS）运作，载体蛋白EIIA^Glc的磷酸化状态反映葡萄糖可利用性；葡萄糖存在时，去磷酸化EIIA^Glc抑制腺苷酸环化酶CyaA，降低cAMP并限制CRP活性。因此，营养感应与QS之间关系尚不完全清楚，AI-2代谢与信号功能的边界是核心问题。研究人员开展本研究，以检验PTS和非PTS糖对lsr表达的影响、CRP调控的保守性、AI-2输入对cAMP的作用，以及环境细菌能否以AI-2为唯一碳源。

主要关键技术方法。研究人员以E. coli MG1655为背景，使用P_lsr–gfp转录融合和流式细胞术检测lsr启动子活性；通过λ-Red重组酶构建Δcrp、ΔlsrR、ΔcyaA等缺失株及crp互补株和CRP^*（CRP^A145T）变体；构建基于CRP^T159A的FRET（荧光共振能量转移）cAMP生物传感器，并在流动室显微系统中测量活细胞cAMP动态。比较基因组分析采用N?pflin et al.提供的19,795个Enterobacteriaceae基因组，覆盖16属80种，并以CollecTF实验验证CRP基序经FIMO扫描。环境菌分离样本来自瑞士苏黎世ETH Zurich H?nggerberg校区的三份草样和两份土壤样本，接种于M9+3 mM DPD/AI-2，分离菌株后进行全基因组测序和鉴定。

研究结果。1）Both PTS and non-PTS sugars inhibit lsr operon expression：研究人员用1 mM PTS糖D-glucose、非PTS糖D-galactose、D-ribose、L-arabinose、lactose，以及pyruvate、acetate、succinate、L-serine处理携带P_lsr–gfp的MG1655细胞1 h。结果显示葡萄糖降低lsr表达，所有测试非PTS糖也抑制lsr表达，而培养物OD₆₀₀增加或不受影响；pyruvate、TCA循环中间物和L-serine无显著影响。结论是营养可利用性可解耦AI-2 QS与细胞密度，并将其耦合至碳源供应。2）cAMP–CRP is required for substrate-dependent modulation of lsr operon activity：Δcrp中基础lsr表达大幅降低，外加AI-2不能恢复；PTS和非PTS糖的抑制在Δcrp中消失，wt crp互补后恢复；在ΔcyaA中携带cAMP非依赖性CRP^*（CRP^A145T）变体时，非PTS糖不抑制lsr。ΔlsrR中基础lsr表达升高但糖抑制仍保持；ΔlsrR Δcrp双突变体与Δcrp相当，表明CRP作用于LsrR上游且独立于LsrR。ΔlsrR背景下pyruvate和L-serine增加lsr表达，且依赖CRP。据此提出CRP相干前馈环模型：CRP直接激活lsrACDBFG和lsrRK；葡萄糖-rich条件下低cAMP限制CRP，替代碳源存在时高cAMP促进CRP，LsrR响应P-AI-2微调操纵子。3）CRP binding sites in the lsrA-lsrR intergenic region are conserved among Enterobacteriaceae：在19,795个基因组中，75%（14,923/19,795）检测到lsr操纵子；Cronobacter、Kosakonia、Plesiomonas无同源物。约50%含lsr的基因组（7,610/14,923）在lsrA-lsrR间区至少有一个CRP结合位点，每个基因组0–3个，平均1.18±1.00。结论是该调控架构在Enterobacteriaceae中广泛保守，并存在谱系特异差异。4）AI-2 import affects intracellular cAMP levels：用FRET cAMP传感器检测发现，葡萄糖预孵育降低FRET比值；随后加入AI-2和所有测试非PTS糖均增加FRET比值；ΔcyaA中无变化；Δlsr仍对胞外AI-2敏感，研究人员推测存在另一尚未鉴定的低亲和AI-2输入系统。实验设计限制使FRET变化不能直接对应绝对胞内cAMP浓度，但AI-2刺激产生的FRET变化与非PTS底物相当，表明AI-2输入与cAMP池变化相关。5）AI-2 can serve as a carbon source in different bacterial species：lsr操纵子结构与功能类似典型糖利用操纵子，LsrB与maltose系统MalE、ribose系统RbsB、galactose系统MglB功能类似，LsrF和LsrG将磷酸化AI-2转化为DHAP和acetyl-CoA。研究人员从草和土壤样本分离14株菌，其中13株可在M9+3 mM DPD/AI-2为唯一碳源中可重复生长。全基因组测序显示多数为Pseudomonas，两株为Acinetobacter calcoaceticus，两株为Escherichia。多数AI-2利用菌缺LsrB，Pseudomonas和Acinetobacter分离株缺LuxS。与D-ribose相比，AI-2通常是较差营养源，但Escherichia分离株在DPD/AI-2和ribose上生长相当，Pseudomonas inefficax 1.1-1在DPD/AI-2上生长优于ribose。Escherichia分离株虽含完整lsr操纵子，但无法构建lsrK突变，限制了对生长是否依赖Lsr系统的判断。结论是AI-2可作为唯一碳源，且该能力可能独立于LuxS/Lsr通路。

讨论部分总结。细菌生活在时空异质环境中，并非通过孤立通路处理信息，而是通过全局调控子、双组分系统、小RNA和通路特异性转录因子组成的互作网络整合营养、胁迫和QS信号。AI-2 QS系统体现这种整合：AI-2产生通过LuxS与活化甲基循环耦合，胞外AI-2由LsrACDB输入，LsrB和Tsr介导趋化，lsr活性还受cAMP–CRP和CCR调控。cAMP–CRP活性依赖EIIA^Glc磷酸化状态，并受PTS葡萄糖摄取和PEP/pyruvate比值调节。研究人员系统测试PTS和非PTS底物，发现葡萄糖和非PTS糖抑制lsr，其他底物无显著作用；抑制依赖cAMP–CRP且独立于LsrR。非PTS糖的抑制可能通过改变PEP/pyruvate比值影响PTS磷酸基团流，从而调节CyaA活性；该模型也可解释ptsI突变中lsr表达受抑制的现象。比较基因组分析表明该调控逻辑广泛保守，约一半含lsr菌株在lsrA上游有CRP位点，谱系间位点数目差异提示调控调谐不同。需注意间区定义和CollecTF基序覆盖限制。翻译后水平上，未磷酸化HPr可抑制LsrK，阻止AI-2磷酸化并阻断LsrR阻遏解除，类似经典诱导物排除。AI-2输入与胞内cAMP变化相关，虽FRET实验限制定性解释，但AI-2行为类似非PTS底物。哺乳动物宿主来源的AI-2类似物L-xylosone和L-xylulose也被提及。lsr操纵子与糖利用系统结构和酶学相似，AI-2胞内加工产生DHAP和acetyl-CoA。E. coli测试菌株不能高效以AI-2为唯一碳源，提示在营养相对丰富条件下AI-2分解可能无显著适应优势并可能丢失。环境分离菌能以AI-2为唯一碳源，多数缺LuxS和LsrB，表明其AI-2分解机制不同于已知Lsr系统，可能独立进化；E. coli中也报道过低亲和、Lsr非依赖性AI-2输入。AI-2合成、分泌后再输入加工，类似乙酸溢出与再利用；在生物膜中，营养暴露细胞产生AI-2，营养稀缺区域可输入代谢。总体而言，AI-2调控整合特异（AI-2）和全局（cAMP）转录调控，AI-2并非孤立QS线索，而是嵌入中心代谢感知通路，其输入、加工和调控后果受群体细胞营养状态塑造。

研究结论翻译。研究人员的发现与先前工作共同表明，AI-2调控整合特异（AI-2）和全局（cAMP）转录调控。AI-2并非作为孤立的群体感应线索发挥作用，而是似乎嵌入中心代谢感知通路中，其输入、加工和调控后果由群体中细胞的营养状态塑造。这强化了AI-2处于营养感应与群体水平通信交汇点的观点。这种整合也可能反映一种进化轨迹：代谢中间物被征用为通信信号，使细菌能够以与个体细胞生理状态耦合的方式协调集体行为。