温度对含水层沉积物氢营养反硝化菌群的影响

《Applied and Environmental Microbiology》：Impacts of temperature on hydrogenotrophic denitrifying aquifer microbiota

　　

地下水是全球重要的饮用水资源，然而农业源硝酸盐污染日益威胁其水质，尤其在溶解氧充足、自然衰减能力有限的浅层含水层中尤为突出。本研究探讨了气态氢气能否刺激受硝酸盐污染的砾石含水层沉积物中的土著化能无机自养反硝化作用，以及该过程在与实验室和现场条件相关的不同温度下是否仍然有效。研究人员假设，在不同温度条件下，微生物群落组成和硝酸盐还原动力学均会发生改变。对来自受硝酸盐污染含水层的沉积物进行微宇宙培养，成功富集了本土氢营养反硝化菌。在12°C、15°C、20°C和25°C条件下定量了反硝化活性，最大速率约为1至1.8 μmol g?1 沉积物 d?1，平均速率总体上符合预期的动力学温度响应规律。较高温度支持了更大的微生物生物量和群落多样性，包括更广泛的反硝化菌种类。然而，在所有温度下，单一群体——一株新型Acidovorax defluvii菌株——主导了整个群落。与异养型模式菌株不同，宏基因组学揭示该菌株拥有一个保守的、可能可转移的用于氢氧化、氢感应和CO?固定的基因簇。尽管具有氢氧化能力的完全反硝化菌在所有温度下均占主导地位，但在低于15°C时亚硝酸盐出现了瞬时积累。所有富集的反硝化菌中均存在好氧呼吸基因，表明它们能够利用氧气作为电子受体（若可获得）。本研究证明了所研究含水层中存在显著的土著氢营养反硝化潜力，并且仅通过注入氢气即可有效刺激该过程。此外，研究还确定了传质限制和氧化还原控制是未来工艺优化的目标。

研究背景与科学问题

地下水是全球重要的饮用水资源，然而农业活动中过量氮肥的使用导致硝酸盐（NO₃^?）污染日益严重，尤其是在浅层、含氧量高的含水层中，自然衰减能力有限，硝酸盐易于积累。在欧洲，许多地下水体已远超欧盟规定的50 mg/L硝酸盐阈值。传统的异养反硝化虽然可通过添加有机碳源进行刺激，但存在卫生安全隐患，尤其在上游饮用水生产井区域。相比之下，利用氢气（H₂）等无机电子供体的化能无机自养反硝化菌通常无致病性，适用于寡营养体系，是一种有前景的原位低风险修复策略。然而，此前关于氢营养反硝化的研究多集中在高于典型地下水温度（如20-35°C）的实验室条件下，缺乏对接近原位低温（如中欧地区约12°C）条件下微生物群落动态和反应动力学的深入认识。因此，本研究旨在探究在受硝酸盐污染的饮用含水层沉积物中，注入氢气能否有效刺激土著氢营养反硝化菌群的活性，并评估这一过程在不同温度下的稳定性与效率。

研究方法与技术路线

研究人员从德国Autenried地区一个受硝酸盐污染（约0.78 mM）的浅层砂砾含水层的三口井（一口饮用水生产井DPW和两口监测井MW1、MW2）采集沉积物样品。研究分为三个阶段：第一阶段为初始富集，在15°C下于无氧Widdel培养基中进行微宇宙培养，反复添加硝酸盐和10%氢气；第二阶段为选择与扩增，选取反硝化活性最高的DPW沉积物扩大培养规模，逐步加入灭菌沉积物以增加接种物量；第三阶段为温度依赖动力学实验，将均质化的富集沉积物分配至100 mL微宇宙瓶中，分别在5°C、12°C、15°C、20°C和25°C下设置五个生物学重复，并设立多种无菌和无底物对照。研究人员采用比色法测定液相中硝酸盐、亚硝酸盐（NO₂^?）和铵根离子（NH₄⁺）浓度，使用气相色谱-热导检测器（GC-TCD）定量氢气消耗，并检测一氧化二氮（N₂O）产生。通过Illumina iSeq 100对16S rRNA基因V4区进行扩增子测序分析微生物群落组成，利用实时荧光定量PCR（qPCR）定量16S rRNA基因、亚硝酸盐还原酶基因nirK和nirS的拷贝数。此外，选取12°C和25°C样品的DNA提取物进行宏基因组鸟枪法测序，组装并分箱获得宏基因组组装基因组（MAGs），并进行功能注释和比较基因组学分析。

研究结果

初始富集与优势菌群鉴定： 经过两个月的初始富集，不同井源沉积物的反硝化速率差异显著，其中DPW沉积物表现出最高的硝酸盐还原速率（0.34至0.3 μmol g^?1 d^?1）。16S rRNA基因扩增子测序显示，原始含水层沉积物中微生物群落高度多样，而富集后群落结构发生剧烈变化，Acidovorax属序列的相对丰度从最初的2%-3%大幅提升至DPW中的约87%，成为绝对优势类群。宏基因组分析进一步确认，该主导菌群被分类为一株Acidovorax defluvii菌株（基于平均核苷酸一致性ANI达97%）。

温度依赖的反硝化动力学： 在12°C至25°C范围内，反硝化活性随温度升高而增强，平均硝酸盐还原速率从12°C的0.74 μmol g^?1 d^?1升至25°C的1.13 μmol g^?1 d^?1。在低于15°C的条件下，亚硝酸盐出现瞬时积累（峰值约34 μM），而在25°C时未检测到亚硝酸盐积累，但观察到少量一氧化二氮（N₂O）的瞬时产生（237 ± 118 ppm）。电子平衡计算表明，除12°C处理外，其他温度条件下的电子回收率均接近100%。5°C条件下未观测到明显的反硝化活性。

温度驱动的微生物群落变化： qPCR结果显示，16S rRNA基因拷贝数随温度升高而递增，从起始的4.5 × 10⁷ copies g^?1增至25°C时的9.0 × 10⁷ copies g^?1。群落组成方面，Acidovorax在低温（12-15°C）下重新占据绝对优势（约70%相对丰度），而在高温（20-25°C）下其优势度下降至约51%，同时Pseudomonas spp.、Rhodocyclaceae和Rhizobiales等类群的丰度显著上升。Shannon多样性指数在12°C和15°C间无显著差异，但在20-25°C时显著高于12-15°C。功能基因定量显示，亚硝酸盐还原酶基因nirS的拷贝数在25°C时显著高于其他温度，与反硝化活性的增强一致。

宏基因组与代谢潜力分析： 共回收了28个高质量的MAGs，覆盖了90%以上的未组装读长。功能注释表明，12个MAGs编码完整的反硝化途径（从硝酸盐到氮气N₂），这些完全反硝化菌在12°C和25°C群落中分别占85%和78%的测序比例。其中，主导的A. defluvii MAG不仅编码完整的反硝化途径，还携带一组独特的基因簇，包含Group 1 [NiFe]-氢化酶、氢感应酶、卡尔文-本森-巴沙姆循环（Calvin-Benson-Bassham cycle, CBB cycle）固碳酶系以及调控元件。该基因簇两端侧翼为转座酶基因，暗示其可能通过水平基因转移传播。比较基因组学分析发现，该几乎相同的基因簇也存在于全球其他三个Acidovorax基因组和一个Hydrogenophaga物种中，表明该氢营养自养能力在环境中具有一定分布广度。

讨论与结论

研究表明，仅通过注入氢气即可有效刺激受硝酸盐污染的含水层沉积物中固有的氢营养反硝化潜力，无需额外生物强化。温度不仅是影响反硝化速率的动力学参数，更是塑造微生物群落结构和功能的决定性因素。低温（12-15°C）下，群落由单一的、携带潜在可移动氢营养基因盒的Acidovorax defluvii菌株主导，呈现动力学受限状态；高温（20-25°C）下，群落向功能更多样的联合体转变，自养反硝化菌（如Acidovorax和Rhodocyclaceae）与异养反硝化菌（如Pseudomonadaceae）共存，表明存在交叉互养作用。这种温度驱动的群落可塑性并未损害总体的硝酸盐去除效率，但低温下亚硝酸盐的瞬时积累提示需要关注中间产物的管理。研究还发现，一个高度保守的、可能通过水平基因转移传播的“氢营养自养基因盒”存在于多种环境来源的Acidovorax基因组中，这挑战了基于基因组和生态位的传统微生物物种定义，并为理解功能性状在环境中的扩散提供了新视角。研究结论指出，微生物自身能力并非原位应用的主要限制因素，传质限制和氧化还原控制才是决定氢营养反硝化技术可行性的关键。该研究为开发基于氢气的原位生物修复策略提供了理论基础，但也强调需要在真实含水层复杂条件下进行验证，并建议未来探索甲烷等其他电子供体以提高过程效率和反硝化完全性。