吡哆醇（PN）通过竞争性抑制与磷酸吡哆醇（PNP）毒性双重机制阻断肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）对其他B6 vitamers的补救代谢

《Applied and Environmental Microbiology》：Pyridoxine can inhibit salvage of other B6 vitamers in Salmonella enterica

　　

摘要专业翻译 吡哆醛5′-磷酸（PLP）是所有生命形式所必需的营养素。作为一种关键辅因子，PLP驱动初级代谢和次级代谢中的酶促反应。微生物可通过de novo PLP生物合成或对外源性维生素B6的补救途径获取PLP。维生素B6在自然环境中以多种形式（vitamers）存在，但混合B6 vitamer补充对微生物生理的影响尚未被探索。本研究考察了肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）在含有不同比例B6 vitamers的培养基中获取PLP的能力。数据显示，B6 vitamer吡哆醇（PN）能够抑制S. enterica pdxH突变体对吡哆胺（pyridoxamine）和吡哆醛（pyridoxal）的补救代谢。研究人员进行了遗传学分析以确定PN干扰吡哆胺和吡哆醛补救的机制。研究人员分离出在吡哆胺补救过程中对PN抑制具有抗性的突变体，并发现这些突变体编码B6激酶（PdxK）的变体，其对B6 vitamer底物的活性发生改变。抑制子分析表明，PN的抑制作用至少部分归因于PN对PdxK吡哆胺激酶活性的竞争性抑制。此外，数据表明吡哆醇5′-磷酸（PNP）介导的毒性也促进了PN对生长的抑制作用。 重要性：若无法成功获取和利用维生素B6，微生物将无法存活，也无法在人类健康与自然环境中发挥其关键作用。维生素B6在自然界中以多种形式（vitamers）存在，但B6 vitamer混合物对微生物生长的影响此前未被分析。本研究揭示，B6 vitamers并非必然是PLP的可互换来源，它们可能对微生物生理产生截然不同的影响。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

维生素B₆以六种vitamer形式存在：吡哆醛（PL）、吡哆醇（PN）、吡哆胺（PM）及其各自的5′-磷酸化形式（PLP、PNP、PMP）。所有细胞均需PLP作为必需辅因子，其获取途径包括de novo生物合成或对外源B₆ vitamers的补救。肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）既可通过DXP依赖途径从头合成PLP，也可通过PdxK/PdxY激酶与PdxH氧化酶构成的补救途径利用外源vitamers。尽管补救途径在物种间高度保守，但不同vitamer进入PLP的代谢路径存在差异，且PdxK对PL、PN、PM的磷酸化效率并不均等。

已有研究表明，过量PN补充可诱导人类PLP缺乏症状，而内源性PNP积累与微生物部分PLP依赖酶活性受损相关。然而，自然环境及宿主环境中B₆ vitamers常以混合比例存在，此前研究尚未系统考察混合vitamer补充对依赖补救途径的微生物生长的影响。本研究旨在填补这一空白，探究混合B₆ vitamer条件下S. enterica的PLP获取效率及其生理后果。

二、研究设计与核心发现

研究人员以S. enterica野生型及三种de novo合成缺陷突变体（ΔpdxH、ΔpdxJ、ΔpdxHΔpdxJ）为对象，在最小甘油培养基中系统评估单一及混合B₆ vitamer对生长的影响。核心发现如下：野生型菌株不受外源vitamer影响；ΔpdxJ突变体可利用PL、PM或PN作为唯一PLP来源正常生长；ΔpdxH突变体可利用PL或PM生长但无法利用PN，且PM补救效率显著低于PL；ΔpdxHΔpdxJ双突变体在PM条件下生长缺陷消失，提示内源性PNP积累抑制了氨基转移酶介导的PM补救。进一步实验表明，在ΔpdxH背景下添加PN可剂量依赖性地抑制PM补救，10 μM PN完全消除生长。PN对PL补救的抑制仅在同时缺失PdxY时显现，表明PdxY作为仅磷酸化PL的激酶可保护PL补救免受PN干扰。

三、主要关键技术方法

本研究主要采用以下关键技术手段：①利用P22噬菌体转导构建系列基因敲除突变体（ΔpdxH、ΔpdxJ、ΔpdxHΔpdxJ、ΔpdxJHK、ΔpdxHJY等）；②通过硫酸二乙酯化学诱变结合选择性平板筛选PN抗性抑制子突变体，并对pdxK位点进行Sanger测序鉴定突变等位基因；③将野生型及突变pdxK等位基因克隆至pCV1（低表达载体）和pTEV20（蛋白纯化载体），在ΔpdxJHK及ΔpdxHJY背景下进行in trans互补实验验证突变功能；④利用Ni-NTA亲和层析纯化PdxK变体蛋白；⑤采用偶联丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶的NADH氧化体系测定PM与PN激酶活性，利用PLP-Tris席夫碱在414 nm处的吸光度测定PL激酶活性。

四、研究结果详解

内源性PNP产生阻碍氨基转移酶介导的PM补救：ΔpdxH突变体在1 μM PM条件下出现显著生长缺陷，而ΔpdxHΔpdxJ双突变体该缺陷消失。由于pdxH突变体中已知存在PNP积累，且PNP可竞争性抑制PLP/PMP依赖的氨基转移酶，研究人员推断内源性PNP通过抑制氨基转移酶活性阻碍了PMP向PLP的转化，从而降低PM补救效率。

缺乏PdxH时PN阻止PM补救依赖的生长：在1 μM PM基础上添加1–10 μM PN，ΔpdxJ突变体生长不受影响（因PdxH可将PN和PM均转化为PLP），而ΔpdxH及ΔpdxHΔpdxJ突变体的PM补救能力被剂量依赖性抑制，10 μM PN完全消除生长。这表明PN对PM补救的抑制严格依赖PdxH缺失这一遗传背景。

分离出抑制PN毒性的pdxK等位基因：通过化学诱变筛选获得四个携带独特pdxK突变（pdxK683编码PdxK^H64Y、pdxK684编码PdxK^T62M、pdxK685编码PdxK^H64N、pdxK686编码PdxK^P63S,H64Y）的PN抗性突变体。所有突变均位于PdxK的vitamer结合位点，其中His64对应于E. coli PdxK中与PL的C4′基团特异性互作的His59。in trans表达实验证实这些等位基因足以赋予PN抗性，其中PdxK^H64N和PdxK^P63S,H64Y提供最强抗性。

PN抗性PdxK变体表现出改变的in vivo PN/PM激酶活性：在ΔpdxJK背景下，所有变体均能以PN为唯一PLP来源支持生长，表明其保留足够PN激酶活性。但以PM为唯一来源时，PdxK^H64Y和PdxK^P63S,H64Y仅支持部分生长，提示这两个变体的PM激酶活性相对较低。

PN抗性PdxK变体具有增强的in vitro PN活性：纯化蛋白活性测定显示，PdxK^H64Y的PL激酶活性高于野生型，其余变体低于野生型；PdxK^T62M和PdxK^H64N的PM激酶活性显著高于野生型；野生型PdxK在in vitro条件下检测不到PN激酶活性（与既往报道一致），而四个变体均表现出显著PN激酶活性。这一发现挑战了PN毒性仅由PNP积累介导的假说，支持PN竞争性抑制PdxK对PM磷酸化的机制——变体通过快速将PN转化为PNP降低游离PN浓度，从而解除对PM激酶活性的竞争性抑制。

PN对PM补救的抑制是多因素共同作用：生化分析支持竞争性抑制PdxK是PN效应的机制之一，但PdxH缺失是PN敏感性的必要条件，原因有二：其一，PdxH缺失导致PNP积累；其二，PdxH缺失迫使PLP必须经由氨基转移酶从PMP产生，而该途径效率较低且易受PNP抑制。因此，PN对PM补救的抑制由PN对PdxK的竞争性抑制与PNP积累对多种PLP依赖酶的有害效应共同介导。

PdxY保护PL补救免受PN敏感性影响：尽管PL是PdxK的底物，但ΔpdxH、ΔpdxJ及ΔpdxHΔpdxJ突变体在1 μM PL条件下添加10 μM PN均不表现生长抑制。S. enterica具有第二种PL激酶PdxY，其仅磷酸化PL且不受PN竞争性抑制。在ΔpdxHJY背景下，PL补救对PN敏感；而表达任一PdxK变体均可恢复PN存在下的PL补救能力，且PdxK^H64Y效果最佳，与其最高的PL激酶活性一致。

五、结论与讨论

本研究证明B₆ vitamer PN不抑制野生型S. enterica生长，但在PLP代谢受扰的特定遗传背景下具有毒性。PN对其它vitamer补救的抑制至少部分通过竞争性抑制PdxK活性实现，PNP对PLP依赖酶的抑制亦贡献于毒性。在S. enterica中，PNP既是de novo PLP合成的中间产物，也是PN补救的产物，因此该菌的代谢网络可能已进化出防止PNP积累的调控机制。

S. enterica的PLP生产具有显著韧性，因其既能de novo合成PLP，又能高效补救PL、PM和PN。然而，自然界中大量微生物缺乏de novo PLP合成能力，完全依赖外源vitamer补救。不同B₆ vitamers在自然环境中的相对丰度可能影响微生物群落的组装与维持，正如维生素B₁₂相关化合物（corrinoids和cobamides）多样性对微生物群落结构的调控作用所示。本研究揭示B₆ vitamers并非可互换的PLP来源，其混合比例对依赖补救途径的微生物生理具有显著影响，这一发现对理解自然环境中维生素营养缺陷型微生物的生存策略及微生物群落动态具有重要意义。