《Stresses》：Evaluating Heat Tolerance in Leaf Mustard (Brassica juncea) Using Cell Membrane Thermostability Across Multiple Environments with AMMI and GGE Biplot Analyses
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热胁迫日益制约叶用芥菜（Brassica juncea）的生产，然而，用于筛选耐热性及评估基因型跨环境稳定性的方法仍十分有限。本研究建立了一种基于相对伤害率（RI, %）的快速耐热性筛选方法，该指标以热处理条件下的细胞膜热稳定性（CMT）表示。初步温度响应试验
热胁迫日益制约叶用芥菜（Brassica juncea）的生产，然而，用于筛选耐热性及评估基因型跨环境稳定性的方法仍十分有限。本研究建立了一种基于相对伤害率（RI, %）的快速耐热性筛选方法，该指标以热处理条件下的细胞膜热稳定性（CMT）表示。初步温度响应试验显示，RI呈S形增长，其中45 °C对基因型间差异的区分度最大，因此被选为耐热性评价温度。研究人员对来自缅甸和日本的6份叶用芥菜种质在5个播种环境下进行了评价。联合方差分析揭示了基因型、环境及基因型与环境互作效应均显著，表明耐热性受遗传控制，同时也受环境条件影响。采用加性主效应和乘性互作（AMMI）模型及基因型主效应加基因型与环境互作（GGE）双标图评估了基因型跨环境的稳定性。分析表明，JP256550（M3）具有最低且最优的CMT基因型选择指数（GSI），而Yamagata seisai和Miike takana具有最低的AMMI稳定性值（ASV），其CMT跨环境表现最为稳定。相比之下，JP256560（M1）和JP256554（M4）表现出更强的环境敏感性和特定适应性。不同播期亦加速了植株发育和开花，缅甸种质比日本种质更早抽薹。结果表明，在45 °C下测定的CMT结合多环境稳定性分析，是有效的耐热性筛选表型工具，为鉴定稳定基因型提供了实用途径，并提示M3是未来耐热育种的候选材料。
一、研究背景与意义
叶用芥菜（Brassica juncea）是芸薹属中重要且高度多样化的物种，其种子因辛辣风味和30%至40%的高含油量而在全球广泛栽培，叶片类型则因强烈辛辣味和较好的采后新鲜度而在东南亚国家广泛用于腌制。温度是影响种子萌发和幼苗建成的主要非生物胁迫因素。25至35 °C的温度促进芸薹属物种的水分吸收并加速萌发，但幼苗期长期热胁迫（27–35 °C）可使叶用芥菜的商品鲜重降低高达58%。此外，夏季长日照会导致早花、缩短营养生长期并降低叶片产量。作为冷季作物，叶用芥菜在日本东京通常在早春（4月）或秋冬（9–10月）栽培，但日益增加且不可预测的温度条件正对传统栽培时期构成挑战。因此，建立可靠的耐热性评价方法并鉴定耐热基因型，对于培育耐热叶用芥菜至关重要。细胞膜热稳定性（CMT）通过电解质渗漏测定，是植物耐热性广泛应用的生理指标，但叶用芥菜的最适评价温度尚未确定。野生近缘种和传统种质是提供非生物胁迫改良多样性的重要遗传资源，本研究材料为采集自热带高温高湿地区缅甸的地方品种。耐热性是由多基因控制的复杂数量性状，受环境因素强烈影响，因此多环境试验（MET）必不可少，而理解基因型与环境互作（GEI）对于鉴定具有广泛适应性的优良品系至关重要。在此方面，方差分析（ANOVA）、加性主效应和乘性互作（AMMI）模型以及基因型主效应加基因型与环境互作（GGE）模型是有效方法。因此，本研究旨在开发和验证基于CMT的叶用芥菜耐热性评价方法，并通过AMMI和GGE双标图分析鉴定日本多环境下表现优良、稳定且广泛适应的基因型。
二、研究内容与主要技术方法
研究人员首先开展了初步试验，对10份不同地理来源的叶用芥菜品种/种质在25、35、45、55和65 °C下进行热处理30分钟，通过电解质渗漏测定相对伤害率（RI），拟合S形响应曲线并估算LT50（50%膜损伤致死温度），据此确定45 °C为最佳评价温度。随后，研究人员选取6份基因型，包括3份缅甸种质（JP256550、JP256554、JP256560）和3份日本栽培品种（Yamagata seisai、Murasaki takana、Miike takana），在日本东京农业大学世田谷校区温室中，于2022–2023和2023–2024生长季开展了5个播种环境（E1至E5，按热暴露程度从高到低排列）的多环境试验。主要技术方法包括：基于电解质渗漏的CMT测定；结合ANOVA、AMMI模型及AMMI稳定性值（ASV）和基因型选择指数（GSI）的稳定性分析；GGE双标图分析（采用无缩放、环境中心化、奇异值分配至基因型得分）；以及生长性状（株高、叶片数、抽薹天数）的观测与Tukey多重比较检验。
三、主要研究结果
3.1 初步试验：CMT评价的热处理优化
RI随温度升高呈S形响应曲线增加，各品种/种质的LT50集中在45和50 °C附近，其中45 °C对品种/种质间差异的区分最为清晰，因此被选定为后续耐热性评价温度。在45 °C下，10份材料的RI差异显著（p < 0.05），Murasakinaga obatakana的RI最低（14.9%），而未知种质最高（74.6%）。田间生长评价根据最终株高将材料分为三组，每组内RI与高温期株高呈负相关（r = ?0.61至?0.99），表明RI较低的材料在高温下更能维持株高。
3.2 多环境评价：不同环境下CMT的月际变化
在E1、E2、E3和E4四个环境中，种质间平均CMT差异显著，而E5中无显著差异。E3（2023年5月）和E2（2023年8月）的平均CMT最低（约51%），E4（2022年9月）最高（62.10%）。M3的平均CMT最低（44.10%），其次为Miike takana（49.86%），M1和M4最高（59.58%和60.78%）。M3在E2、E3和E4中均保持较低CMT，而M1和M4表现出相反的环境响应趋势。
3.3 CMT及农艺性状的联合方差分析
联合ANOVA显示，环境（E）、基因型（G）及基因型与环境互作（GEI）对CMT、株高和叶片数均有极显著影响（p < 0.001）。基因型分别解释了CMT、株高和叶片数总变异的31.15%、23.83%和45.90%。环境效应对株高和叶片数影响突出（分别占65.21%和45.23%），但对CMT贡献较小（14.99%）。GEI对CMT的变异贡献达27.24%，明显高于对株高（9.92%）和叶片数（7.34%）的贡献。
3.4 CMT的AMMI分析
AMMI分析显示G、E和GEI效应均极显著，前两个互作主成分轴（IPCA1和IPCA2）解释了90.34%的互作模式（IPCA1占59.09%，IPCA2占31.25%）。在AMMI双标图中，E3互作最低，E2和E5相对稳定，E1和E4互作较强。基因型中Yama稳定性最高，其次为Miike和M3。ASV范围为3.68至34.71，Yama的ASV最低（最稳定），其次为Miike（13.68）和M3（13.87），M4和M1的ASV最高（21.59和34.71）。GSI范围为4至11，M3和Miike最低（4），M1和M4最高（11）。
3.5 GGE双标图
由于较低的CMT表示较高的耐热性，研究人员将CMT转换为反向CMT（CMTr = 100 ? CMT）后进行GGE双标图分析。GGE双标图解释了总G + GE变异的89.22%（PC1占63.28%，PC2占25.94%）。2022年的E1和E4之间关系密切，2023年的E2、E3和E5之间关系密切。在which-won-where多边形图中，Miike、M3、Mura、M1和M4位于多边形顶点。M3所在扇区包含除E5外的所有环境并表现最优，E5位于M3与Mura扇区的分界线上。M1和M4所在扇区不包含任何测试环境。均值与稳定性视图显示，M3沿平均环境轴（AEC）方向距离最远且投影较短，表明其CMTr均值最高且相对稳定；Yama投影也较短，但位于AEC原点另一侧，CMTr值较低。
3.6 不同环境下叶用芥菜的生长与发育性状
株高均值从E4的22.41 cm到E3的52.20 cm不等，叶片数在E4中最少（6片），E3中最多（14片）。Mura的株高和叶片数在所有环境中均最高。抽薹时间在不同环境和基因型间差异显著，E3中抽薹最早（移栽后50天），E4、E5和E2中显著延迟（分别为123、124和127天）。M3抽薹最早（49天），Miike最晚（141天）。
四、讨论与结论
讨论部分指出，CMT是可靠的耐热性指标，45 °C处理温度与经典CMT研究一致。CMT在较温暖条件下普遍较低，可能反映了热驯化效应，即田间高温预暴露增强了细胞膜抵抗后续热处理的能力。GEI对CMT影响显著，表明仅基于合并均值的选择可能忽视稳定材料或环境特异性材料，AMMI模型结合ANOVA和PCA能更好地解释GEI。与AMMI双标图相比，GGE双标图排除了环境主效应，更易于直观解释和实际选择。综合ASV和GGE分析，M3是最有前景的基因型，兼具高耐热性和跨环境稳定性。早花可能是耐热逃逸机制，有助于植物避免末端热胁迫。
研究结论部分翻译如下：本研究确立了45 °C作为基于CMT区分叶用芥菜耐热性的有效温度。结果进一步表明，先前暴露于热胁迫可能诱导热驯化，与最适条件下生长的植株相比减少了膜损伤。基因型、环境和基因型与环境互作的显著效应表明，耐热性由遗传和环境因素共同决定，强调了多环境评价的重要性。在5个环境中，AMMI和GGE双标图分析一致地将M3（JP256550）鉴定为高性能基因型，在E2、E3和E5中表现尤为优异。其在不同环境下的稳定表现表明其可作为培育耐热叶用芥菜的亲本材料，并可用于后续QTL分析以解析该性状的遗传基础。其他基因型如Yama（Yamagata seisai）、M4（JP256554）和M1（JP256560）可作为后续验证的对比材料，其中Yama因稳定性最高而特别有价值。此外，本研究建立的基于CMT的筛选方法为耐热适应性的表型鉴定和评价提供了快速且经济有效的途径，结合多环境测试和分子方法，该方法可促进高温胁迫下叶用芥菜的高效选择和遗传改良。
