人诺如病毒感染不能诱导人肠道类器官分泌血清素

《Journal of Virology》：Human norovirus infection does not induce serotonin secretion in human intestinal organoids

摘要专业翻译 人诺如病毒（Human noroviruses, HuNoVs）是全球急性胃肠炎的主要病原体之一。HuNoV相关疾病的主要症状为呕吐和腹泻，然而这些症状背后的机制目前尚不清楚。由肠道内分泌细胞（enteroendocrine cells, EECs）分泌的神经活性激素，如血清素（5-hydroxytryptamine, 5-HT），可激活大脑呕吐中枢，并在调控催吐信号中发挥关键作用。在其他肠道感染中，受感染EECs释放的血清素被认为与呕吐有关。近期研究在免疫功能低下慢性HuNoV感染患者及恒河猴的空肠活检组织中检测到EECs内的HuNoV RNA和抗原。因此，本研究探讨了人肠道类器官（human intestinal organoids, HIOs）感染HuNoV是否诱导血清素分泌。研究使用成人及婴儿空肠HIO模型，包括一种多西环素诱导的neurogenin-3 HIO细胞系（其EECs数量增加），检测了多种GII基因群（genogroup II）HuNoV毒株的感染情况及血清素分泌水平。ELISA检测结果显示，在成人及婴儿HIOs中，HuNoV感染均未诱导血清素分泌。与肠上皮细胞（enterocytes）是HuNoV主要靶细胞类型相一致的是，GII.4 HuNoV在亲本HIOs中复制强劲，但在EEC富集培养物中复制水平降低。此外，来自亲本HIOs的上清液未能刺激EEC富集HIOs释放血清素。综上，这些发现表明HuNoV感染肠道上皮细胞不足以在HIOs中触发血清素释放。这些结果提示，HuNoV相关呕吐不太可能直接源于上皮细胞分泌血清素，可能还需要其他细胞组分参与，如免疫或神经信号通路，或可能涉及其他神经活性激素。

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一、研究背景与意义

人诺如病毒（Human noroviruses, HuNoVs）是全球各年龄段人群急性胃肠炎的主要病原体，每年约导致6.77亿例感染病例，直接医疗成本超过40亿美元，社会总成本超过600亿美元。HuNoV感染的主要症状是呕吐和腹泻，但病毒诱导这些胃肠炎症状的机制目前尚不清楚。在已知的催吐机制中，肠道内分泌细胞（enteroendocrine cells, EECs）分泌的神经活性激素如血清素（5-hydroxytryptamine, 5-HT）可通过肠神经信号激活大脑呕吐中枢。轮状病毒（rotavirus）感染诱导血清素分泌已被证实是引起呕吐的机制之一，临床上血清素受体拮抗剂昂丹司琼（ondansetron）也已被用于急性病毒性胃肠炎患者的止吐治疗。近期两项研究在免疫功能低下患者和恒河猴的空肠活检组织中检测到HuNoV RNA或衣壳蛋白存在于EECs中，提示感染EECs并分泌血清素可能是HuNoV相关呕吐的潜在机制。然而，HuNoV感染是否确实诱导血清素分泌尚不清楚。本研究利用人肠道类器官（human intestinal organoids, HIOs）这一生理相关模型，系统探究了多种GII HuNoV毒株感染后血清素的分泌情况。

二、研究内容与主要结论

研究人员利用成人空肠HIO系（J2 parental）及其基因修饰的neurogenin-3（NGN3）诱导细胞系（Unind NGN3和Ind NGN3，后者在doxycycline诱导下EECs比例显著升高至约47.6%–51%），以及两个天然表达较多EECs的婴儿空肠HIO系（J1005和J1006），感染了多种HuNoV毒株，包括三株GII.4 Sydney [P31]（BCM16-2、TCH12-580、TCH15-82）、一株GII.4 Sydney [P16]（TCH24-163）和一株GII.3 [P12]（TCH23-1447）。通过RT-qPCR检测病毒复制水平，ELISA检测培养上清液中血清素浓度，免疫荧光染色检测病毒衣壳蛋白VP1与EEC标志物嗜铬粒蛋白A（chromogranin A, ChgA）及肠上皮细胞标志物蔗糖酶-异麦芽糖酶（sucrase isomaltase, SI）的共定位情况。研究还设置了严格的对照组，包括未感染组、γ射线灭活病毒（g.GII.4）处理组，以及碳酰胆碱（carbachol）阳性对照组，并用人轮状病毒（HRV）G6[P8]感染作为病毒介导血清素释放的阳性对照。

三、研究结果

GII.4 Sydney [P31] HuNoV在EECs增加的成人HIOs中复制和感染水平较低

通过RT-qPCR检测发现，三株GII.4 Sydney [P31]粪便滤液在Ind NGN3 HIOs中的复制水平较J2 parental和Unind NGN3 HIOs约低1个log₁₀。免疫荧光显示Ind NGN3培养物中ChgA阳性细胞占47.6%，而J2 parental和Unind NGN3分别仅为1.0%和0.8%；相应地，Ind NGN3中VP1阳性细胞比例（2.7%）显著低于J2 parental（8.0%）和Unind NGN3（5.4%）。约0.8%的Ind NGN3细胞同时表达ChgA和VP1，表明部分EECs可被HuNoV感染。

GII.4 Sydney [P31] HuNoV感染不能诱导EECs增加的HIOs释放血清素

ELISA检测显示，仅carbachol处理的Ind NGN3 HIOs检测到显著血清素分泌（均值419 ng/mL），而GII.4感染组（115 ± 18 ng/mL）、g.GII.4处理组（142 ± 49 ng/mL）和未感染组（178 ± 70 ng/mL）之间无显著差异。将支持GII.4高效复制的J2 parental感染上清液转移至Unind NGN3和Ind NGN3 HIOs后，也未观察到血清素水平的显著升高。此外，外源添加doxycycline或血清素均不影响J2 parental中GII.4的复制，排除了这些因素对低复制表型的贡献。

GII.4 Sydney [P31] HuNoV感染不能刺激婴儿HIOs分泌血清素

两个婴儿空肠HIO系（J1005和J1006）支持GII.4 Sydney [P31]的强劲复制（2 hpi至24 hpi间GE/well增加超过2个log₁₀）。尽管carbachol处理诱导了显著的血清素分泌（4.1 ± 1.2 ng/mL），但GII.4感染组（2.0 ± 1.1 ng/mL）与g.GII.4处理组（1.9 ± 0.7 ng/mL）之间无显著差异。

其他GII HuNoVs感染不能诱导HIOs分泌血清素

GII.4 Sydney [P16]感染在Ind NGN3 HIOs中的复制较J2 parental和Unind NGN3约低1个log₁₀，约1.6%的Ind NGN3细胞同时表达VP1和ChgA；GII.4 Sydney [P16]感染诱导的血清素水平（284 ± 63.5 ng/mL）与未感染组（224 ± 33.2 ng/mL）和g.GII.4处理组（254.9 ± 66.4 ng/mL）无显著差异。Transwell实验证实基底侧和顶侧上清液中均无血清素显著升高。HRV G6[P8]感染作为阳性对照可显著诱导血清素分泌，验证了实验系统检测病毒介导血清素释放的能力。GII.3 [P12]感染在三种成人HIO系中复制水平相似（均超过1个log₁₀），VP1阳性细胞比例在Ind NGN3中为8.6%，但血清素水平（179 ± 47 ng/mL）与未感染组（221 ± 27 ng/mL）和g.GII.3处理组（192 ± 40 ng/mL）之间仍无显著差异。

四、讨论与结论

本研究的核心发现是：多种GII HuNoV毒株（GII.4 Sydney [P31]、GII.4 Sydney [P16]和GII.3 [P12]）感染成人及婴儿空肠HIOs均不能诱导血清素分泌，即使在支持病毒高效复制的条件下也是如此。这一结果与轮状病毒形成鲜明对比——轮状病毒通过其肠毒素NSP4介导细胞内Ca²⁺升高，刺激肠嗜铬细胞释放血清素，从而驱动呕吐反应。临床证据也支持这一差异：一项随机双盲安慰剂对照试验显示，昂丹司琼可显著减少轮状病毒感染儿童的呕吐和腹泻持续时间，但对HuNoV阳性儿童无明显改善。

研究人员指出，HIO模型仅包含肠道上皮细胞，缺乏免疫系统和肠神经系统组分，而神经元和免疫细胞的通讯可能在向大脑呕吐中枢传递信号中发挥作用。EECs是多样化的细胞群体，包含L细胞、K细胞、I细胞、S细胞、G细胞、D细胞、M细胞和肠嗜铬细胞等亚群，可分泌PYY、CCK、GLP-1、ghrelin等多种与呕吐症状相关的神经活性激素。因此，HuNoV相关呕吐可能涉及其他神经活性激素或需要更复杂的细胞间信号通路。

研究结论指出，单纯肠道上皮细胞感染不足以刺激HIOs中的血清素分泌，HuNoV相关呕吐不太可能直接由上皮细胞分泌血清素引起，可能涉及免疫或神经信号通路等额外细胞组分，或其他神经活性激素的参与。未来研究应聚焦于EECs分泌的其他神经活性激素，并建立包含肠神经元、免疫细胞和微流控肠-神经平台的复杂共培养体系，以深入探究HuNoV诱导呕吐的发病机制。