CasNano：一种具有GC富集PAM的超紧凑CRISPR-Cas12f，用于具治疗潜力的表观基因组编辑

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：CasNano: An ultracompact CRISPR-Cas12f with a GC-rich PAM for epigenome editing with therapeutic potential

CRISPR-Cas蛋白用于基因组工程的临床使用受其大尺寸限制，限制了体内递送。为解决此问题，研究人员从Blautia lenta的一种最低活性、400个氨基酸的Cas12f蛋白工程化了一个超紧凑且多功能的平台。结构引导的蛋白质诱变和系统的单引导RNA（sgRNA）优化的多阶段策略将BlCas12f转化为“CasNano”，作为哺乳动物细胞的强效基因组靶向工具。当催化失活的CasNano（dCasNano）与VPR结构域融合时，其激活内源基因的效率与特异性在等质量质粒转染下针对所测试的向导RNA（gRNAs）和位点与基准SpCas9系统相当或更优；由于未量化编辑器表达，且化学计量差异在任何情况下都会妨碍等效归一化，这些比较描述的是功能输出而非内在活性。研究人员通过将dCasNano与DNA甲基转移酶（DNMT3A）融合用于基因沉默，或与双加氧酶（TET1）融合用于基因激活，建立了该平台用于双向表观遗传编辑的多功能性。TET1介导的再激活在人胚胎干细胞（hESCs）中持续5个月，而DNMT3A沉积的甲基化在分裂报告细胞系中2周时未保留。CasNano的小尺寸和独特的CCN PAM序列突显了其在受病毒递送货物容量限制的未来治疗应用中的潜力。

研究背景：CRISPR-Cas（成簇规律间隔短回文重复及相关蛋白）技术已改变活细胞基因组修饰，推动基础与临床科学。酿脓链球菌Cas9（SpCas9）系统可实现精准基因组编辑，而其核酸酶失活形式（dCas）与效应域融合后，可通过靶向转录和表观遗传修饰改变基因表达。临床转化受限于其大尺寸，AAV（腺相关病毒）仅能携带约4.7 kb，常被Cas编码序列超出，尤其融合功能效应器时；脂质纳米颗粒（LNP）递送也受益于更紧凑的mRNA。常用效应器SpCas9（约1,368 aa）和Cas12a/Cpf1（约1,300 aa）较大，SaCas9（约1,053 aa）仍占据显著AAV容量。已探索Cas12e和超紧凑Cas12f等更小系统，如CasX（约980 aa）、UnCas12f1/CasMINI（约529 aa）、AsCas12f1变体（约422 aa）。但微型蛋白多需长AT-rich PAM（前间区序列邻近基序），如SaCas9 5′-NNGRRT-3′、CasX 5?-TTCN-3?、CasMINI 5?-TTTR-3?，限制靶向位点及GC-rich启动子/增强子的治疗修饰。因此，需要紧凑高效的CRISPR系统。

研究人员从Blautia lenta鉴定400 aa的BlCas12f，筛选其PAM，发现偏好短CG-rich PAM，核心为5′-CCN-3′，在-2和-3位几乎绝对需要胞嘧啶，-1和-4位灵活。野生型在哺乳动物细胞中几乎无切割活性；引入D216A和D390A后失活，融合VPR转录激活域，并将天然CRISPR RNA（crRNA）与反式激活crRNA（tracrRNA）连接形成sgRNA。通过结构引导、ESM-1b蛋白语言模型预测和迭代饱和诱变，研究人员获得V11，即dCasNano。sgRNA支架从233 nt优化至136 nt的variant 18。dCasNano-VPR在TRE3G-RFP报告基因中与dSpCas9-VPR相当，反义链约高4倍MFI；错配敏感性和全转录组脱靶分析显示高特异性；可激活内源HBG1和IL1RN；DNMT3A融合可靶向甲基化沉默；TET1融合可去甲基化再激活，并在29-G hESC中维持5个月。该研究的意义在于，CasNano尺寸小、效率高、特异性强，且具有治疗有利的CCN PAM，为AAV/LNP递送受限的细胞和基因治疗提供新平台。

关键技术方法概括：研究人员采用基于HMM（隐马尔可夫模型）的生物信息挖掘，从Pfam PF07282查询Blautia lenta及宏基因组数据库，筛选350–450 aa的Cas12f候选；对BlCas12f进行结构引导与ESM-1b预测的迭代饱和突变；系统截短和改造sgRNA支架；在HEK293T和hESC中进行等质量质粒转染；利用流式细胞术、qRT-PCR、RNA-seq、亚硫酸氢盐测序和Cas-OFFinder预测脱靶。样本来源方面，GAPDH-Snrpn和DAZL-Snrpn报告HEK293T细胞系由Dr. Shawn Liu（Columbia University）赠予，29-G hESC报告细胞系为已报道。

研究结果：
将超紧凑Cas12f蛋白工程化为强效基因组靶向工具：研究人员筛选BlCas12f，确定其5′-CCN-3′ PAM；初始dBlCas12f-VPR活性可忽略。基于结构比对和ESM-1b鉴定22个候选残基，饱和诱变后组合获得V1–V6，活性较野生型提高约600%；再对6个Cas12a家族比对残基饱和诱变得V7–V11，活性翻倍，V11命名为dCasNano。利用双PAM报告（5′-CCN-N₂₀-NGG-3′）直接比较，dCasNano-VPR在正义链与dSpCas9-VPR相当，在反义链约高4倍MFI。结论：天然BlCas12f被转化为高效基因组靶向工具。
系统改造sgRNA支架以缩短长度并提升dCasNano活性：初始233 nt sgRNA结构复杂。系统截短tracrRNA茎，variant 3删除茎1–3活性最高，支架缩短至140 nt；多数内部结构元件为功能必需，loop-5修饰耐受。variant 18组合耐受linker和有益loop-5修饰，长度136 nt且活性最佳；与V11配对后仍最佳。结论：获得紧凑高效的sgRNA支架。
工程化dCasNano表现出高特异性且对错配耐受低：构建20 nt原型间隔区每个位置单核苷酸转换错配sgRNA库。dCasNano-VPR在位置1–15对错配比dSpCas9-VPR更敏感，尤其1–7种子区；RNA-seq显示两系统全转录组脱靶均小；Cas-OFFinder预测候选脱靶，两编辑器均未系统性激活，log₂倍数变化分布无差异。结论：dCasNano具有高基因组靶向特异性。
利用dCasNano-VPR系统激活内源基因：选择HBG1和IL1RN，设计4条sgRNA池靶向启动子，使用相同间隔序列比较。72 h qPCR显示，HBG1正义和反义链激活与dSpCas9类似；IL1RN正义链类似，反义链dCasNano-VPR高约3.3倍（p=0.010）。结论：dCasNano-VPR可有效激活内源人基因。
使用DNMT3A-dCasNano融合进行靶向表观遗传沉默：将dCasNano与DNMT3A催化域融合。在GAPDH-Snrpn-EGFP报告细胞中，6天后约25% EGFP阴性，MFI下降，与DNMT3A-dSpCas9相当；亚硫酸氢盐测序显示靶向CpG位点甲基化类似或超过dSpCas9。内源MECP2启动子中，DNMT3A-dCasNano诱导甲基化增加，而dSpCas9较低。但2周后甲基化回到对照范围，未证明持久沉默。结论：CasNano可高效靶向甲基化沉默，但在该分裂报告系统中不持久。
在HEK293T和hESCs中进行靶向去甲基化与基因再激活：TET1-dCasNano再激活DAZL-Snrpn-mCherry报告，mCherry阳性率与TET1-dSpCas9相当，靶向Snrpn启动子甲基化降低。在29-G hESC中，TET1-dCasNano再激活沉默的MECP2-tdTomato报告，阳性率与dSpCas9相当，MFI更高；再激活稳定维持5个月，亚硫酸氢盐测序证实靶向MECP2启动子CpG甲基化持续丢失。结论：TET1-dCasNano可实现持久表观遗传再激活。

讨论部分总结：蛋白质工程发现，将候选残基替换为精氨酸并非最优，赖氨酸、组氨酸或不带电残基可赋予更高活性，提示需优化DNA结合界面的立体化学和电荷分布，而非单纯增加正电荷。sgRNA工程将支架缩短至136 nt，有利于AAV递送，但比SpCas9和工程化CasMINI ge3.1更长，核心tracrRNA元件多属功能必需。CasNano超紧凑（约1.2 kb）和CCN PAM带来治疗优势：AAV可容纳dCasNano、sgRNA盒及多种效应域，如碱基编辑器ABE/CBE、转录调节域VPR/KRAB、表观修饰域TET1/DNMT3A；生物信息分析显示，在19,477个人基因TSS上游500 bp中，CasNano平均有89.9个可靶向位点，接近SpCas9，远高于Cpf1/Cas12a 13.5、CasX/Cas12e 15.7、CasMINI/Cas12f 8.3、Cas12j 61.2；在12,348个含启动子相关CpG岛的基因中，CasNano和SpCas9平均247.3个位点，远超其他系统。比较采用等质量DNA转染，描述功能输出，不区分内在活性；CasNano为二聚体，可能向每个结合位点递送两个效应器拷贝。其核酸酶活性低于SpCas9，因工程以转录激活为唯一读出，优化了DNA结合而非切割；Cas12f产生交错末端，非同源末端连接修复效率低。TET1-dCasNano介导的再激活和甲基化丢失在29-G hESC中维持5个月；DNMT3A-dCasNano沉积的甲基化在GAPDH-Snrpn-EGFP HEK293T报告2周时未保留，可能与多拷贝慢病毒整合、邻近组成型GAPDH启动子和快速分裂细胞有关。研究结论翻译：总之，通过蛋白质和sgRNA双重工程化策略，研究人员将一种最低活性的天然蛋白转化为强大的基因组工程工具。CasNano的超紧凑尺寸、高效率、稳健特异性及治疗上有优势的PAM序列，使其成为CRISPR工具箱中有价值的补充。CasNano为可编程基因组和表观基因组工程提供了新平台，在细胞和基因治疗中具有潜在应用，并展示了一种广泛适用的策略，可释放通过天然Cas蛋白生物信息挖掘发现的其他新型Cas效应器的潜力。