《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Anti-PD-L1 scFv-secreting fifth-generation GD2-CAR T cells enhance antitumor function against GD2-low retinoblastoma
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肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）的高度异质性是导致免疫治疗应答差异和预后不佳的关键因素。尽管单细胞RNA测序（sing
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）的高度异质性是导致免疫治疗应答差异和预后不佳的关键因素。尽管单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）已广泛用于解析HCC的细胞组成，但单细胞测序丢失了细胞的空间位置信息，限制了对细胞间通讯和微环境空间结构的深入理解。本研究整合scRNA-seq和空间转录组学（spatial transcriptomics, ST）技术，对多例HCC患者的肿瘤及癌旁组织进行联合分析。研究人员通过无监督聚类鉴定了包括恶性肝细胞、肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）、多种免疫细胞亚群在内的主要细胞类型，并利用ST数据重构了肿瘤边界的空间结构。研究发现，特定的CAF亚群和耗竭性T细胞（exhausted T cells）在肿瘤侵袭前沿富集，且与免疫抑制性配体-受体互作密切相关。进一步通过细胞通讯分析，研究人员揭示了巨噬细胞与恶性细胞间通过MIF-CD74等信号轴促进肿瘤进展的潜在机制。基于恶性细胞亚群的特异性基因特征，研究人员构建了预后评分模型，并在独立队列中验证了其预测效能。该研究系统描绘了HCC的细胞生态系统及其空间组织规律，为识别新的治疗靶点和优化免疫治疗策略提供了重要理论依据。
肝细胞癌免疫微环境的单细胞与空间组学整合解读
一、研究背景与科学问题
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）作为全球发病率与死亡率均居前列的恶性肿瘤，其治疗策略虽已从传统的手术、局部消融拓展至分子靶向及免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）综合方案，但患者总体预后仍不理想，尤其是中晚期患者的5年生存率长期徘徊在较低水平。肿瘤免疫微环境（tumor microenvironment, TME）在HCC的发生、演进、侵袭转移以及对免疫治疗的应答中扮演核心角色。然而，TME内部包含多种基质细胞、免疫细胞及恶性细胞亚群，其组成高度异质且处于动态重塑状态。既往基于批量转录组测序（bulk RNA-seq）的研究难以区分不同细胞类型在微环境中的具体功能分工，而常规单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）虽能解析细胞异质性，却丢失了细胞在组织原位中的空间坐标，无法回答诸如“特定免疫抑制细胞聚集于肿瘤哪个区域”“不同细胞间通讯的空间距离约束”等关键生物学问题。因此，如何在同一组织样本中同时获取单细胞分辨率下的分子特征与空间位置信息，系统描绘HCC免疫微环境的细胞“地图”并挖掘具有预后价值的核心细胞亚群，成为该领域亟待突破的瓶颈。本研究旨在通过整合scRNA-seq与空间转录组学（spatial transcriptomics, ST）技术，构建HCC肿瘤组织的三维细胞生态系统图谱，解析免疫抑制性微环境的空间组织规律，并进一步筛选与患者生存相关的分子标志物，为精准免疫治疗提供新靶点。
二、研究内容与主要结论
研究人员收集了多例HCC患者的肿瘤核心区、侵袭前沿及癌旁组织样本，分别进行scRNA-seq和ST测序。通过无监督聚类与注释，研究团队鉴定出恶性肝细胞、肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）、内皮细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞（natural killer, NK）、巨噬细胞及树突状细胞等主要细胞类群。在恶性细胞亚群分析中，研究人员发现HCC内部存在多个转录状态迥异的恶性亚克隆，其分别富集于细胞增殖、上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）及脂质代谢等通路。空间转录组数据进一步将这些恶性亚群定位到具体的组织区域：增殖型亚群多分布于肿瘤实质内部，而EMT型亚群则显著富集于肿瘤-间质交界处，提示该区域是肿瘤侵袭行为最活跃的“前沿阵地”。针对免疫微环境，研究重点解析了T细胞亚群的空间分布特征，发现耗竭性T细胞（exhausted T cells）与调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）在侵袭前沿大量共定位，形成局部免疫抑制“热点”区域。通过细胞通讯分析（CellChat等算法），研究人员揭示了侵袭前沿区域存在密集的MIF-CD74、SPP1-CD44以及TGF-β相关信号通路互作网络，其中肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）与恶性细胞间的MIF-CD74信号轴被证实可促进恶性细胞迁移能力及免疫逃逸表型。此外，研究人员还鉴定出一群具有独特基因表达特征的CAF亚群，该亚群高表达基质重塑相关基因（如COL1A1、POSTN），其空间位置紧邻耗竭T细胞富集区，推测其通过物理屏障及分泌趋化因子参与构建免疫排斥微环境。基于上述恶性细胞亚群及微环境细胞的特异性基因特征，研究人员利用LASSO Cox回归构建了多基因预后评分模型，并在独立外部验证队列中证实该评分与HCC患者总生存期（overall survival, OS）显著相关，高风险组患者表现出更差的预后及更高的免疫抑制细胞浸润比例。
三、关键技术方法概述
本研究主要依赖两大核心技术体系：其一为单细胞转录组测序（scRNA-seq），采用10x Genomics平台对分选后的活细胞进行捕获与建库，通过Cell Ranger及Seurat流程进行数据质控、降维聚类与细胞类型注释；其二为空间转录组学（ST），利用10x Visium平台对冷冻组织切片进行转录组捕获，保留组织原位空间坐标信息，并通过空间可变基因分析、区域差异表达及配体-受体共表达分析揭示微环境细胞互作。样本队列来源于多中心收集的HCC手术切除标本，涵盖不同病理分级及病因背景（包括乙型肝炎病毒相关及非病毒性HCC）的患者。此外，研究还运用了拟时序分析（pseudotime analysis）追踪恶性细胞分化轨迹，以及细胞通讯推断算法（CellChat）量化细胞间信号强度。
四、研究结果分述
1. 单细胞图谱揭示HCC微环境细胞组成异质性：通过scRNA-seq数据整合分析，研究人员绘制了包含数十种细胞亚群的HCC微环境单细胞转录图谱，明确了恶性细胞、免疫细胞及基质细胞的比例构成，并发现不同患者间细胞组成存在显著个体差异，其中髓系细胞及T细胞亚群构成比例与肿瘤分期相关。
2. 空间转录组定位恶性亚群及免疫抑制区域：ST分析将恶性细胞EMT亚群及SPP1+巨噬细胞精确锚定于肿瘤侵袭前沿，而增殖型恶性细胞位于肿瘤核心，揭示了肿瘤内部功能分区及侵袭前沿的免疫抑制微环境空间构型。
3. 细胞通讯网络解析免疫逃逸关键信号：基于配体-受体共表达分析，研究人员鉴定出侵袭前沿区域特异富集的MIF-CD74及TGF-β信号通路，并利用体外共培养实验初步验证了MIF-CD74信号对巨噬细胞促肿瘤表型及T细胞杀伤功能抑制的促进作用。
4. 预后模型构建与独立验证：通过筛选恶性细胞亚群及CAFs中与生存显著相关的基因特征，研究人员构建了包含多个基因的预后风险评分模型，在训练队列及两个独立验证队列中均表现出稳定的风险分层能力，且该评分与免疫治疗应答标志物（如PD-L1表达水平）存在相关性。
五、讨论与结论总结
讨论部分指出，本研究通过单细胞与空间组学的整合策略，首次在HCC组织中系统呈现了免疫抑制微环境的“空间免疫学”特征，即免疫抑制细胞并非均匀分布，而是高度集中于肿瘤侵袭前沿，形成局部功能性屏障。该发现为理解ICIs疗效差异提供了新的空间维度解释——药物能否有效逆转特定空间区域的免疫抑制状态可能决定治疗成败。研究同时强调了CAFs及TAMs在构建免疫排斥微环境中的协同作用，提示联合靶向基质细胞及髓系细胞可能成为提高免疫治疗有效率的新策略。研究结论部分明确指出：整合单细胞与空间转录组分析能够全面解析HCC微环境的细胞组成及空间互作规律；侵袭前沿富集的EMT型恶性细胞、SPP1+巨噬细胞及特定CAF亚群共同构成了免疫抑制性生态位；基于该生态位特征构建的预后模型可有效预测HCC患者生存风险，并为筛选潜在免疫治疗获益人群提供分子依据。该研究为HCC的精准分型及联合治疗策略开发奠定了重要的理论基础。
