Esaxerenone通过抑制NR3C2介导的TLR4/NF-κB和TGF-β/Smad信号通路减轻高盐联合醛固酮诱导的肾脏炎症与纤维化

《Renal Failure》：Esaxerenone attenuates renal injury by inhibiting NR3C2-mediated inflammatory and fibrotic pathways

　　

肾脏炎症和纤维化是多种肾脏疾病的病理特征。高盐饮食和醛固酮是诱导肾脏疾病的危险因素。Esaxerenone 是有效治疗高血压的盐皮质激素受体阻断剂（mineralocorticoid receptor blocker, MRB）。本研究旨在观察 Esaxerenone 对高盐饮食联合醛固酮输注大鼠模型中肾脏炎症的影响。研究人员发现，接受高盐饮食联合醛固酮处理的大鼠表现出更严重的肾脏病理损伤。同时，肾损伤分子-1（kidney injury molecule-1, KIM-1）、Toll样受体4（toll-like receptor 4, TLR4）、磷酸化核因子κB（phospho-nuclear factor kappa-B, p-NF-κB）、F4/80、白介素-6（interleukin-6, IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）和干扰素γ（interferon gamma, IFN-γ）的表达增加（p < 0.05）。此外，高盐饮食联合醛固酮可上调转化生长因子β（transforming growth factor-beta, TGF-β）、p-Smad2、p-Smad3、α平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin, α-SMA）、波形蛋白（vimentin）和I型胶原（collagen I）的表达（p < 0.05）。然而，给予 Esaxerenone 可改善高盐饮食联合醛固酮诱导的这些表达和肾脏病理损伤（p < 0.05）。这些数据表明，Esaxerenone 可能通过调控 TLR4/NF-κB 和 TGF-β/Smad 信号通路来减轻高盐联合醛固酮诱导的肾脏炎症和纤维化。

慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）是重要公共卫生问题，其进展在很大程度上取决于肾纤维化（renal fibrosis）程度。肾纤维化是多种 CKD 终末期共同病理表现，特征为炎症细胞浸润、成纤维细胞增殖和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）沉积，最终破坏正常肾脏结构并导致肾功能进行性下降。高盐饮食和醛固酮参与肾损伤、炎症和纤维化进展。新证据提示盐皮质激素受体（mineralocorticoid receptor, MR）激活触发促炎和促纤维化级联，协同加速肾损伤。Esaxerenone 是一种新型口服非甾体高选择性 MR 拮抗剂，已批准用于高血压管理，并在减少蛋白尿和减缓 CKD 进展方面显示疗效；研究显示其可减少 DKD 小鼠蛋白尿、肾小球损伤、肾脏炎症、氧化应激和肾小管间质纤维化，既往研究也显示其可降低高盐加醛固酮模型大鼠血压并减轻肾损伤。炎症反应参与肾纤维化，炎症因子释放促进肾纤维化发生发展。Toll样受体4（toll-like receptor 4, TLR4）过度表达或过度激活可促进 CKD 进展，并介导核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）激活；TGF-β/Smad 也是肾损伤起始和进展的关键介质。转化生长因子β₁（transforming growth factor-beta₁, TGF-β₁）是 TGF 家族经典成员，是纤维化的强刺激因子，通过刺激 ECM 产生和抑制降解介导进行性肾纤维化；Smad2 和 Smad3 是主要下游介质，Smad3 主要介导肾纤维化，缺失 Smad3 可减少纤维生成。高盐摄入刺激 TGF-β 产生导致进行性纤维化，醛固酮也可通过激活 MR 上调 TGF-β₁ 促进肾纤维化。因此研究人员开展高盐饮食联合醛固酮输注大鼠模型，进一步表征 MR 介导的炎症和纤维化级联，并为 MRB（esaxerenone）多面肾脏保护作用提供证据，扩展其在醛固酮过量和高盐摄入诱导的 CKD 中超越抗高血压应用的治疗意义。

研究人员选用 SPF 雄性 Wistar 大鼠（5周，120±10 g），购自 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.（SCXK 2021–1-0006）。适应7天后随机分为 CON、ALD+HSD（醛固酮输注+8%高盐饮食）和 MRB（醛固酮输注+8%高盐饮食+esaxerenone）组，每组6只。除 CON 组外切除左肾；ALD+HSD 与 MRB 组植入微型渗透泵输注醛固酮 600 μg/kg/d，6周后移除；MRB 组给予 esaxerenone 1 mg/kg/d。6周后采集血和肾组织。主要技术包括 HE 与 Masson 染色及半定量病理评分，免疫组化检测 α-SMA、vimentin、Collagen I、F4/80、TNF-α、IL-6，Western blot 检测 KIM-1、TLR4/NF-κB、炎症因子、TGF-β₁/Smad、核/总 NR3C2、SGK-1 等，GAPDH 为内参，核 NR3C2 以 H3 为内参；SPSS 26.0 行单因素 ANOVA 与 Tukey 检验，p < 0.05 为显著。

3.1 Esaxerenone alleviates the renal pathological damage induced by high-salt diet plus aldosterone（Esaxerenone 减轻高盐饮食联合醛固酮诱导的肾脏病理损伤）。HE 染色显示，与 CON 组相比，ALD+HSD 组出现严重肾小管损伤，包括肾小管排列紊乱、管腔扩张增加和炎症细胞浸润；esaxerenone 可减轻高盐饮食联合醛固酮诱导的肾小管损伤。Western blot 显示 KIM-1 在 ALD+HSD 组上调，而 esaxerenone 可显著抑制 KIM-1 表达。这些结果表明 esaxerenone 可减轻高盐饮食联合醛固酮诱导的肾脏病理损伤。

3.2 Esaxerenone improves high-salt diet plus aldosterone-induced renal fibrosis（Esaxerenone 改善高盐饮食联合醛固酮诱导的肾脏纤维化）。高盐联合醛固酮输注显著上调 ALD+HSD 组 α-SMA、vimentin 和 collagen I 表达。TGF-β 信号在 db/db 小鼠肾脏中被激活，介导巨噬细胞增殖并促进肾脏炎症和损伤；本研究发现 ALD+HSD 组 TGF-β₁ 表达以及 p-Smad2 和 p-Smad3 水平增加。esaxerenone 处理有效降低这些蛋白表达并减少纤维化面积。这些发现提示 esaxerenone 可通过抑制 TGF-β₁ 信号通路改善高盐联合醛固酮诱导的肾脏纤维化。

3.3 Esaxerenone alleviates high-salt diet plus aldosterone-induced renal inflammatory response（Esaxerenone 减轻高盐饮食联合醛固酮诱导的肾脏炎症反应）。高盐饮食和过量醛固酮与肾脏炎症相关，TLR4/NF-κB 轴是经典炎症信号通路。Western blot 显示，与 CON 组相比，ALD+HSD 组肾组织中 TLR4 和 p-NF-κB 表达显著升高，并观察到明显的 NF-κB 核转位。为验证 TLR4/NF-κB 激活的功能相关性，研究人员检测 F4/80、IL-6、TNF-α 和 IFN-γ 等促炎细胞因子，发现高盐饮食联合醛固酮可诱导这些细胞因子显著增加，而 esaxerenone 处理显著减弱 F4/80、IL-6、TNF-α 和 IFN-γ 的上调。这些结果提示 esaxerenone 可通过抑制 TLR4/NF-κB 轴改善高盐联合醛固酮诱导的肾脏炎症。

3.4 Esaxerenone may inhibit renal inflammation and fibrosis induced by high-salt diet plus aldosterone through suppressing the activation of MR（Esaxerenone 可能通过抑制 MR 激活抑制高盐饮食联合醛固酮诱导的肾脏炎症和纤维化）。MR（NR3C2）是配体依赖转录因子，其过度激活驱动肾损伤。研究发现，与 CON 组相比，ALD+HSD 组核 NR3C2 积累显著增加，而 esaxerenone 处理有效逆转其核转位。与 NR3C2 激活一致，MR 介导病理反应的关键效应因子 SGK-1 在 ALD+HSD 组也增加。为进一步探索 NR3C2（MR）激活在驱动高盐饮食联合醛固酮诱导肾损伤中的作用，研究人员进行 Pearson 相关分析，评估 NR3C2 与病理标志物（炎症、纤维化和肾小管损伤）之间的关系。结果显示，NR3C2 表达与多个促炎和促纤维化指标显著正相关。这些结果揭示，MR 激活可能作为驱动因素，协调炎症和纤维化级联，促进高盐饮食联合醛固酮诱导的肾损伤。

讨论部分总结：炎症细胞浸润是肾脏病理最重要特征之一，并伴随肾功能降低。证据支持炎症与纤维化相关，炎症是肾间质纤维化所必需。Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）/NF-κB 通路和 TGF-β/Smad 通路是促进 CKD 发病的主要通路，炎症介质释放增加可促进 CKD 进展。TLR 是模式识别受体，广泛存在于免疫细胞，也存在于非免疫细胞，尤其是上皮和内皮细胞。TLR4 介导肾纤维化中的促炎和促纤维化通路，临床研究显示 CKD 患者 TLR4 表达上调，并与 TNF-α、IL-6 和单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1, MCP-1）等多种生物介质释放增加相关。NF-κB 是 TLR4 信号通路下游效应因子，也是经典重要核转录因子，可介导多种炎症过程。既往研究已探讨高盐和醛固酮对肾损伤发生发展的单独和协同作用，因此本研究主要讨论高盐饮食联合醛固酮对炎症细胞因子表达的影响。结果显示，高盐饮食联合醛固酮可导致 TNF-α、IL-6、IFN-γ、TLR4 和 p-NF-κB 上调。TGF-β/Smad 信号通路可介导 ECM 积累并促进肾纤维化发展。TGF-β 超家族包含一系列细胞因子生长因子，控制增殖、迁移、分化以及 ECM 分泌和沉积等多种细胞功能。TGF-β₁ 是促进慢性肾病纤维化的主要因子，已证明 TGF-β₁ 及其下游激活促进 ECM 积累，导致肾间质纤维化。Smad2 和 Smad3 是促进 TGF-β₁ 介导组织纤维化的两个主要下游调节因子。本研究结果提示，高盐饮食联合醛固酮增加 TGF-β₁ 表达以及 Smad2 和 Smad3 磷酸化。许多证据提示 MR 过度激活在调节炎症、胶原形成和纤维化中起重要作用，是 CKD 进展的主要决定因素。研究证明 MR 激活可诱导肾脏巨噬细胞浸润或极化，从而促进肾脏炎症和纤维化。研究人员也揭示高盐饮食联合醛固酮可激活肾脏 RAAS，从而激活 MR，最终促进和加重肾脏病理损伤。SGK-1 是醛固酮下游因子；既往研究证明 SGK-1/TGF-β 通路在 UUO 孕鼠模型肾纤维化过程中起作用。醛固酮通过激活 NR3C2 调节 SGK-1 表达和活性，从而影响 TLR4/NF-κB 和 TGF-β₁/Smad 通路，最终促进肾脏病理发展。此外，MR 激活还可增加 IFN-γ、NF-κB 和 IL-6 等多种通路活性，这与炎症和纤维化密切相关。本研究发现高盐饮食联合醛固酮可增加 SGK-1 和炎症因子表达，这与 MR 激活相关。MR 阻断剂可减少肾脏炎症和纤维化。Esaxerenone（也称为 CS-3150）是第三代 MRB，已批准治疗高血压。与其他 MRB 相比，esaxerenone 具有更高结合特异性，因为它对糖皮质激素或性激素受体没有激动或拮抗作用，从而降低高钾血症和内分泌紊乱风险。尽管 MRB 通过降低血压预防进展性肾病，但它可能通过抑制促纤维化和炎症介质表达发挥作用。Esaxerenone 可通过与醛固酮竞争性结合 MR 抑制 MR 活性，从而减少过度 MR 激活诱导的促炎和促纤维化因子释放，最终减轻肾脏炎症和纤维化。为检测高盐饮食联合醛固酮是否通过激活 MR 诱导肾脏炎症和纤维化，研究人员使用 esaxerenone 抑制 MR 激活。结果显示，esaxerenone 可减少高盐饮食联合醛固酮诱导的炎症和纤维化因子表达，从而发挥肾脏保护作用。这些发现可能为预防 CKD 提供新视角。然而，本研究中 MR 介导的肾脏保护作用不能脱离血流动力学或利尿效应。本研究仅观察体内炎症相关因子和纤维化相关蛋白变化，具体机制有限；同时，当前研究仅提供高盐联合醛固酮模型中炎症和纤维化通路的额外分子表征，具体因果通路应进一步探索。未来研究将开展实验探索具体机制和细胞实验。

研究结论翻译：本研究结果表明，高盐饮食联合醛固酮诱导肾脏炎症和纤维化。Esaxerenone 可能减轻肾脏炎症和纤维化，并伴随 NR3C2 激活及下游炎症/纤维化通路标志物的抑制。