槟榔咀嚼习惯通过全基因组DNA低甲基化与致癌通路激活启动口腔肿瘤发生

《International Dental Journal》：Habitual Betel Nut Chewing Primes Oral Tumourigenesis Through Global DNA Hypomethylation and Oncogenic Pathway Activation

摘要专业翻译 摘要 引言与目的：口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔颌面部区域的主要恶性肿瘤。除烟草和酒精使用外，槟榔咀嚼是OSCC的重要病因学因素，尤其在东亚、南亚和东南亚地区；然而，其潜在机制仍知之甚少。本研究旨在探讨习惯性槟榔咀嚼在OSCC肿瘤发生中的作用，并提供可能的预测性生物标志物。 方法：研究人员对包含1108例患者的临床队列进行了分析。分析了OSCC组织和正常癌旁组织（normal adjacent tissues，NATs）的全基因组DNA甲基化水平。通过用槟榔碱（arecoline）处理细胞在体外验证了研究结果。进行了DNA甲基化与转录组数据的多组学整合，以识别关键基因和信号通路。研究结果使用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据、临床样本和OSCC仓鼠模型进行了验证。 结果：习惯性槟榔咀嚼与口腔内第二原发肿瘤（second primary tumours，SPTs）发生率增加具有特异性关联。虽然与NATs相比，OSCC组织表现出全基因组DNA低甲基化，但来自习惯性咀嚼者的NATs表现出显著的低甲基化。多组学整合揭示，习惯性槟榔咀嚼改变了NATs，使其更类似于OSCC组织。五个关键枢纽基因——ANLN、DEPDC1B、ECT2、PLK1和SPC25——是OSCC肿瘤发生的潜在驱动因子。这些基因的上调在临床样本中以及在槟榔诱导的OSCC仓鼠模型中得到确认，该模型也再现了持续槟榔暴露下OSCC形成的增加。 结论：研究结果表明，习惯性槟榔咀嚼促进OSCC的发展，其机制可能是在非恶性口腔黏膜中诱导全基因组DNA低甲基化并激活致癌通路。 临床意义：评估DNA甲基化状态和关键基因表达可作为OSCC早期检测和预防的生物标志物和靶点。

论文解读

一、研究背景与科学问题

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤。尽管手术、放疗、化疗和免疫治疗等综合治疗手段不断进步，OSCC患者的5年生存率仍仅维持在50%至60%的水平。即使手术效果良好的患者，也常面临严重的术后面部毁容和心理困扰。因此，从病因学角度开发有效的诊断手段和早期干预策略至关重要。

在已知的OSCC风险因素中，吸烟、饮酒和人乳头瘤病毒感染已被确立，但流行病学数据明确显示，槟榔咀嚼是南亚和东南亚地区（包括中国）OSCC发生的主要贡献因素。印度作为槟榔消费量最大的国家，其OSCC发病率居全球之首；中国湖南省的槟榔咀嚼习惯同样导致OSCC患者数量显著增加。因此，深入理解槟榔咀嚼与OSCC发生发展之间的关联，对于制定槟榔咀嚼人群的早期肿瘤筛查和监测策略十分必要。

肿瘤发展主要由遗传因素与环境因素的相互作用介导。与体细胞突变相比，表观遗传改变可能是遗传-环境相互作用中的关键节点。槟榔咀嚼作为一种外部环境因素，可能影响口腔黏膜细胞的表观遗传状态，导致肿瘤抑制基因下调、癌基因激活，最终促进OSCC的发生。DNA甲基化作为最重要的表观遗传机制之一，已在包括OSCC在内的多种肿瘤中被证实参与其中。因此，研究槟榔咀嚼与口腔黏膜甲基化改变之间的调控机制，是理解槟榔咀嚼如何促进OSCC发展的有效途径。

二、研究设计与主要发现

研究人员分析了2017年至2019年间确诊的OSCC患者临床队列，共纳入1108例完成5年随访的患者，根据是否习惯性咀嚼槟榔（每周至少一次，每次超过3颗）分为习惯性咀嚼组和非习惯性咀嚼组。通过回顾性队列分析发现，习惯性槟榔咀嚼并未显著影响OSCC患者的无病生存期（disease-free survival，DFS），但按复发类型分层后显示，习惯性咀嚼者口腔内第二原发肿瘤（oral cavity–located second primary tumours，O-SPTs）的发生率显著升高（OR=2.994，P=0.0104），提示槟榔咀嚼可能通过促进新原发肿瘤的形成参与OSCC肿瘤发生。

在机制层面，研究人员对OSCC组织和正常癌旁组织（normal adjacent tissues，NATs）进行了全基因组DNA甲基化分析。结果显示，OSCC组织较NATs表现出显著的全基因组DNA低甲基化，但习惯性与非习惯性咀嚼者的OSCC组织之间未检测到显著甲基化差异，槟榔碱处理OSCC细胞系也未改变其整体甲基化水平。然而，来自习惯性咀嚼者的NATs表现出显著低于非习惯性咀嚼者的DNA甲基化水平，槟榔碱处理非恶性口腔上皮细胞同样导致整体甲基化水平下降。850K甲基化芯片分析进一步显示，习惯性咀嚼者NATs中低甲基化差异甲基化CpG位点（hypomethylated differentially methylated CpG sites，hypoDMCs）显著增多，且富集于启动子区域TSS200和TSS1500，相关基因主要涉及免疫和炎症信号通路。

通过整合DNA甲基化与转录组数据的多组学分析，研究人员鉴定出525个在习惯性咀嚼者NATs中启动子低甲基化且转录上调的甲基化相关差异表达基因。这些基因的表达模式使习惯性咀嚼者的NATs在转录水平上更接近OSCC组织。进一步分析确定了38个在习惯性咀嚼者OSCC组织中进一步上调的基因，包括基质金属蛋白酶13、10和1，富集于增殖相关信号通路。通过蛋白质-蛋白质相互作用网络分析，鉴定出10个枢纽基因，其中ANLN、DEPDC1B、ECT2、PLK1和SPC25的高表达在TCGA OSCC队列中与不良预后显著相关。免疫组化验证了这5个基因在习惯性咀嚼者NATs中的高表达，并在DMBA联合槟榔碱处理的仓鼠OSCC模型中证实了其中4个基因在NATs中的上调，同时该模型显示出更高的肿瘤形成率和更早的肿瘤发生时间。

三、主要技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：基于Illumina Infinium Human MethylationEPIC BeadChip（850K芯片）的全基因组DNA甲基化检测；利用MethylFlash甲基化定量试剂盒评估整体DNA甲基化水平；整合既往转录组测序数据集（GSE186775）进行多组学分析；采用Metascape在线工具进行基因功能富集分析；使用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络并通过马尔可夫聚类算法鉴定枢纽基因；利用组织微阵列和免疫组化验证目标蛋白表达；建立DMBA联合槟榔碱诱导的仓鼠OSCC模型进行体内验证；使用癌症基因组图谱（TCGA）OSCC队列数据进行生存分析。临床样本来源于湘雅医院2017至2019年间收治的OSCC患者。

四、研究结果分述

槟榔咀嚼显著增加OSCC患者第二原发肿瘤风险：通过对1108例OSCC患者的回顾性队列分析，习惯性槟榔咀嚼未显著影响DFS，但分层分析显示其与O-SPTs发生率显著升高相关，支持槟榔暴露对正常黏膜的长期致癌作用。

OSCC组织DNA低甲基化及槟榔咀嚼者甲基化谱比较：OSCC组织较NATs表现出显著的全基因组DNA低甲基化，但习惯性与非习惯性咀嚼者的OSCC组织间无显著甲基化差异，槟榔碱处理OSCC细胞系亦未改变甲基化水平，提示槟榔对恶性细胞的甲基化影响有限。

习惯性槟榔咀嚼降低NATs的DNA甲基化：习惯性咀嚼者NATs的整体甲基化水平显著低于非习惯性咀嚼者，启动子区域hypoDMCs富集，相关基因涉及免疫和炎症通路，表明槟榔暴露在组织学正常的口腔黏膜中诱导了表观遗传改变。

多组学分析揭示槟榔相关NAT改变的关键基因和通路：整合甲基化和转录组数据鉴定出525个启动子低甲基化且上调的基因，使NATs呈现肿瘤样表达谱；38个基因在OSCC组织中进一步上调，富集于增殖相关通路；ANLN、DEPDC1B、ECT2、PLK1和SPC25被鉴定为与不良预后相关的枢纽基因。

枢纽基因验证及槟榔咀嚼在OSCC中的促肿瘤作用：免疫组化证实5个枢纽基因在习惯性咀嚼者NATs中高表达；DMBA联合槟榔碱的仓鼠模型表现出更高的肿瘤形成率和更早的肿瘤发生，且除PLK1外的4个基因在模型NATs中显著上调。

五、讨论与结论

既往关于槟榔咀嚼对OSCC预后的影响在不同人群中结果不一。本研究发现槟榔咀嚼不影响DFS但显著增加O-SPTs发生率，支持区域癌化理论——慢性致癌物暴露在正常外观组织中诱导不可逆的遗传和表观遗传改变。槟榔咀嚼对OSCC组织甲基化影响有限，因为这些细胞已处于整体低甲基化状态；但在NATs中，槟榔暴露诱导的启动子低甲基化和基因异常激活可能先于肿瘤形成，使正常组织呈现肿瘤样转录特征。低甲基化相关基因富集于免疫相关通路，提示槟榔咀嚼可能通过降低DNA甲基化损害抗肿瘤免疫，促进恶性转化。研究结论表明，习惯性槟榔咀嚼通过诱导口腔黏膜全基因组DNA低甲基化和癌基因异常激活，促进OSCC的发生发展，包括第二原发肿瘤的形成。评估DNA甲基化状态和关键基因表达可作为OSCC早期检测和预防的生物标志物与靶点。