《PLOS One》：Network toxicology, molecular docking and molecular dynamics simulations for bisphenol A neurotoxicity in depression pathogenesis
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双酚A（Bisphenol A, BPA）作为一种广泛存在的环境内分泌干扰物，能够穿越血脑屏障并发挥与抑郁症发病密切相关的神经毒性效应。然而，介导BPA诱导抑郁症的精确分子靶点及信号通路仍知之甚少。本研究整合网络毒理学、分子对接、分子动力学模拟、
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双酚A（Bisphenol A, BPA）作为一种广泛存在的环境内分泌干扰物，能够穿越血脑屏障并发挥与抑郁症发病密切相关的神经毒性效应。然而，介导BPA诱导抑郁症的精确分子靶点及信号通路仍知之甚少。本研究整合网络毒理学、分子对接、分子动力学模拟、GEO转录组数据集分析及小鼠体内实验验证，系统探究BPA在抑郁症中潜在的毒理学靶点及其潜在机制。研究人员从ChEMBL、STITCH和SwissTargetPrediction数据库中预测BPA相关靶点，并从GeneCards、OMIM和TTD数据库中检索抑郁症相关靶点。对重叠靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建及GO和KEGG富集分析。通过分子对接和100 ns分子动力学模拟验证BPA与核心靶点之间的结合亲和力及结构稳定性。共筛选出29个重叠靶点，显著富集于神经突触功能、神经递质结合及神经活性配体-受体相互作用通路。研究鉴定出5个核心枢纽基因，包括INS、ESR1、SLC6A4、GRIA1和NTRK2，均与BPA表现出稳定的特异性结合及良好的结合自由能。基于多个GEO数据集的进一步验证证实，这5个核心基因在重度抑郁症（MDD）患者中显著下调，同时伴随神经营养及胰岛素相关通路的显著抑制。体内动物实验进一步证明，BPA暴露加重小鼠抑郁样行为，并显著下调脑组织中5个核心分子的mRNA及蛋白表达。综上，本研究鉴定出BPA诱导抑郁症的关键神经毒性相关靶点及分子通路，为未来机制研究及临床干预策略提供理论基础。
论文解读
一、研究背景与目的
环境内分泌干扰物（EDCs）广泛存在于日常环境和消费品中，人群暴露普遍。慢性EDC暴露与癌症、生育能力受损、代谢紊乱及神经发育障碍等多种不良健康结局相关，近年研究亦将其确认为人类精神健康障碍的关键促成因素。双酚A（BPA）作为EDC中的重要成员，是一种塑料单体，广泛存在于塑料制品、个人护理用品及家居用品中，人群生物监测数据已证实普通人群的广泛暴露。BPA能够结合多种雌激素受体并触发多种细胞反应，且具有血脑屏障（BBB）通透性，可穿越BBB在脑组织中蓄积，诱导中枢神经炎症并引发焦虑和抑郁障碍。产前BPA暴露与儿童焦虑、抑郁和多动症状相关，慢性BPA暴露可加重成年雄性小鼠的抑郁样表型。然而，BPA诱导抑郁症的精确分子靶点和通路在很大程度上仍不清楚。抑郁症是一种普遍且致残性强的疾病，其发病机制涉及遗传和环境因素，小胶质细胞介导的神经炎症是其已确立的病理组分。近年来，慢性暴露于包括EDCs在内的环境污染物与抑郁症的关联受到关注，但BPA导致抑郁症的具体机制尚未被系统阐明。基于此，本研究整合网络毒理学、分子对接和分子动力学模拟，旨在鉴定介导BPA诱导抑郁症的关键遗传靶点和信号通路，为理解BPA神经毒性及制定BPA暴露相关抑郁症的防治策略提供理论依据。
二、主要技术方法
研究人员综合运用多种计算与实验技术开展研究。首先，利用ProTox和ADMETlab平台预测BPA的毒理学效应；从ChEMBL、STITCH和SwissTargetPrediction数据库收集BPA相关靶点（置信度≥0.7），从GeneCards（相关性评分>10）、OMIM和TTD数据库收集抑郁症相关靶点，通过Venny 2.1.0鉴定重叠基因；利用STRING数据库和Cytoscape 3.7.2构建PPI网络并计算节点度值；采用clusterProfiler R包进行GO和KEGG富集分析；使用AutoDock Vina 1.1.2进行分子对接，以ESR1（PDB: 1ERE）为阳性对照、溶菌酶（PDB: 1AKI）为对接对照；使用GROMACS 2023.2进行100 ns分子动力学模拟，采用amber99sb-ildb和gaff力场，并进行MM-GBSA结合自由能计算；利用GEO数据库中GSE26063、GSE102556、GSE38206和GSE32280四个转录组数据集进行差异表达分析和GSEA富集分析；最后采用成年雄性C57BL/6J小鼠（8周龄，20–25 g，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司）进行体内实验，通过蔗糖偏好实验（SPT）和旷场实验（OFT）评估抑郁样行为，并采用Western blot和qPCR验证核心分子的蛋白和mRNA表达水平。
三、研究结果
3.1 BPA毒性预测结果。 通过ProTox数据库预测，BPA被赋予预测毒性类别5，提示其固有的中等毒性。毒性模型报告显示，BPA对BBB、雌激素受体α（ERα）、雌激素受体配体结合域（ER-LBD）和线粒体膜电位具有激活毒性效应。ADMETlab数据库预测结果表明BPA对眼部腐蚀具有强毒性效应。这些发现揭示了BPA相互关联的毒性终点，建立了BPA暴露与抑郁症致病机制之间的机制联系。
3.2 BPA和抑郁症潜在靶点。 通过ChEMBL、STITCH和SwissTargetPrediction数据库，经阈值设定和去重后鉴定出760个潜在的BPA相互作用靶点；从GeneCards、OMIM和TTD数据库检索到447个抑郁症相关靶点。通过Venny 2.1.0工具鉴定出29个重叠靶点，作为BPA诱导抑郁毒性的候选靶点。将29个重叠靶点上传至STRING数据库构建PPI网络，得到29个节点和192条边。
3.3 GO富集分析。 对29个重叠基因进行GO富集分析。生物学过程（BP）方面显著富集于神经功能、血管调节和外源物反应相关通路；细胞组分（CC）分析显示靶基因主要富集于神经突触和离子转运相关结构；分子功能（MF）分析突出其与神经递质结合、离子转运和通道活性的关联。
3.4 KEGG富集分析。 鉴定出23条主要信号通路，可分为三大类：神经功能调节通路（包括神经活性配体相关信号、血清素能、GABA能和多巴胺能突触通路）、物质成瘾相关通路（包括尼古丁成瘾和吗啡成瘾）以及细胞信号通路（包括cAMP信号通路和钙信号通路）。其中神经活性配体-受体相互作用通路的p值最低，富集最显著。
3.5 分子对接结果。 通过PPI网络分析和节点度计算，INS、ESR1、SLC6A4、GRIA1和NTRK2为度值最高的前5个基因。分子对接结果显示BPA与5个关键基因均具有良好结合亲和力，结合能值均低于?5.00 kcal/mol。29个靶点的对接结合能范围为?2.8 kcal/mol（IFNA2）至?8.5 kcal/mol（NTRK2）。
3.6 分子动力学模拟结果。 对5个关键蛋白-BPA复合物进行100 ns MD模拟。RMSD分析显示所有复合物均未出现持续上升趋势，大部分在模拟中期趋于稳定，确认良好的构象稳定性。配体位移分析显示GRIA1的BPA结合最稳定（100%轨迹帧在0.3 nm以内），SLC6A4以稳定结合为主（62.3%），NTRK2和ESR1显示部分位移，INS-BPA复合物显示最大位移（平均0.668 nm），提示BPA在模拟条件下未与INS维持稳定结合。RMSF分析显示各复合物在关键区域波动有限。Rg和SASA分析确认BPA结合未诱导靶蛋白整体结构紧密度和表面可及性的重大变化。氢键分析显示各复合物在整个模拟过程中保持稳定的非共价相互作用。MM-GBSA计算得到各复合物的ΔG_bind值均为负值（ESR1 ?34.2±3.95、INS ?28.5±5.94、NTRK2 ?36.4±4.28、SLC6A4 ?37.6±4.00、GRIA1 ?36.8±3.31 kcal/mol），表明热力学上有利的结合。
3.7 转录组数据验证。 对4个独立GEO数据集的分析显示MDD患者存在显著差异表达基因。GSE38206数据集的GSEA分析显示神经营养和胰岛素相关通路在MDD患者中显著下调。INS、ESR1、SLC6A4、GRIA1和NTRK2的表达水平在多个数据集的MDD患者中均较健康对照显著下调。
3.8 体内实验验证。 蔗糖偏好实验和旷场实验证实BPA加重抑郁样症状，表现为蔗糖摄入减少、旷场总探索距离减少、开放区域探索距离减少和平均探索速度降低。Western blot分析显示50 mg/kg BPA处理下调小鼠脑组织中INS、ESR1、SLC6A4、NTRK2和GRIA1的蛋白表达。qPCR进一步确认BPA处理下调这5个基因的mRNA表达。
四、讨论与结论
讨论部分指出，5个核心靶点的选择基于PPI网络度中心性和BPA结合亲和力两个独立标准的收敛。非核心靶点如MYL3（?8.2 kcal/mol）和ESR2（?7.8 kcal/mol）虽显示良好结合能，但因缺乏中枢神经系统表达或抑郁症发病机制中的明确作用而被排除。INS编码的胰岛素在CNS中合成并发挥神经保护作用，胰岛素抵抗与抑郁症双向关联，BPA与INS的稳定结合可能干扰胰岛素构象或受体结合，导致中枢胰岛素抵抗。ESR1是大脑情绪和记忆相关区域雌激素信号的关键介质，BPA作为选择性雌激素受体调节剂（SERM），其与ESR1的结合可能改变ESR1的转录活性，破坏雌激素信号。SLC6A4编码的5-HTT蛋白调节突触血清素可用性，BPA诱导的SLC6A4表达下调可能降低血清素再摄取能力，导致突触血清素耗竭。GRIA1编码AMPA受体的GluA1亚基，介导快速兴奋性传递和突触可塑性，BPA诱导的GRIA1下调可能损害AMPA受体功能，破坏前额叶-边缘回路的兴奋/抑制平衡。NTRK2编码BDNF的高亲和力受体TrkB，对神经可塑性和应激韧性至关重要，BPA对TrkB功能的干扰可能损害BDNF信号，减少海马和前额叶皮质的神经发生和突触可塑性。GO和KEGG富集分析显示重叠基因显著富集于神经突触功能、神经递质结合和神经活性配体-受体相互作用通路，BPA对5个靶点的同时结合和下调提示多靶点打击机制。研究局限性包括：基于计算预测和模拟的发现需进一步机制验证；每个复合物仅分析一条100 ns生产MD轨迹，未进行独立重复轨迹；配体位移分析显示INS复合物中BPA从初始对接姿态显著移动；GEO数据不能直接证明BPA暴露与靶点下调之间的因果关系；BPA常与其他EDCs共存，需研究其协同或相加效应。
结论部分总结指出，本研究整合网络毒理学、分子对接和分子动力学模拟技术，探究BPA暴露与抑郁症发病之间关联的潜在分子机制。共鉴定出29个介导BPA对抑郁发病影响的靶点，其中关键枢纽靶点包括INS、ESR1、SLC6A4、GRIA1和NTRK2，核心通路包括神经突触通路、神经递质结合通路和神经活性配体-受体相互作用通路。这些发现为BPA在抑郁症发病中的作用提供了新见解，为抑郁症的药物开发和临床治疗奠定理论基础。然而，仍需利用基础和临床的体外和体内模型进行进一步实验验证。
