基于图Transformer的结直肠“腺瘤-癌”关键基因探索研究

《PLOS One》：Exploring the key genes of colorectal “adenoma-cancer” based on graph transformer

　　

结直肠癌（CRC）是全球致死率最高的恶性肿瘤之一，从结肠腺瘤到癌症的生物标志物的精准识别对预防腺癌发展具有重要意义。鉴于现有方法未能充分捕捉基因间的拓扑网络关系，本研究提出了一种基于多特征学习的图神经网络模型，命名为ChebTs，用于探究结直肠“腺瘤-癌”转变过程中关键基因的相关性。来自GEO数据库的GSE41657和GSE31905数据集被分为正常组、腺瘤组和结直肠癌组。研究人员引入特征编码以增强节点特征，随后对差异表达基因（DEGs）进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。利用Cytoscape软件构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并将聚合信息嵌入模型进行训练，生成带有相应重要性分数的关键基因列表。注意力池化机制将节点级表征聚合成图级表征用于样本分类，经过激活和正则化后的两层全连接网络产生预测概率。此外，研究人员利用GNNExplainer在基因层面提供了可解释性分析，并通过虚拟敲除技术验证了结果。筛选出的八个基因——纤连蛋白1（FN1）、密蛋白2（CLDN2）、白细胞介素-33（IL-33）、基质金属肽酶1（MMP1）、斯钙素2（STC2）、胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP7）、NADPH氧化酶4（NOX4）和分泌型卷曲相关蛋白1（SFRP1）——均被发现与结直肠癌的总生存期（OS）相关。本研究筛选出八个与结直肠腺癌发展密切相关的分子，它们可能成为结直肠癌的诊断生物标志物。这些基因通过参与细胞外机制重塑等生物学过程影响患者预后，对预防腺瘤癌变具有重要意义。

一、研究背景与现存问题

结直肠癌（CRC）是全球最常见且致死率最高的恶性肿瘤之一，其发病机制遵循明确的逐步进展模式，“腺瘤-癌”序列被认为是结直肠肿瘤发展的经典范式。正常黏膜通过腺瘤性息肉演变为浸润性癌的突变过程，由一系列影响癌症相关通路的基因组改变驱动。因此，精准识别这一过程中的关键基因，对于阐明结直肠癌发生的分子机制、发现早期诊断生物标志物以及实施个性化治疗策略至关重要。

然而，现有的关键基因识别方法存在明显局限性。传统的差异表达分析未能考虑基因间相互作用、共表达或通路关联所形成的复杂网络结构。肿瘤发展本质上是网络调控系统的失衡。此外，高通量组学数据具有高维度、小样本、高噪声和稀疏性的特点，基于机器学习的筛选方法应用于此类数据容易出现“维度灾难”问题，导致模型过拟合和泛化能力差。尽管已有一些基于图神经网络（GNN）的方法如EMOGI、MTGCN和DGMP被用于癌症驱动基因预测，但它们分别存在无法捕获全局信息、缺乏结构编码、以及因使用全局平均池化而导致结构信息丢失等问题。

二、研究内容与结论

为解决上述问题，研究人员提出了一个名为ChebTs的新型图神经网络模型，该模型结合了局部拓扑编码与全局注意力机制，用于识别结直肠腺瘤向癌症进展过程中的关键基因。该模型整合了切比雪夫插值网络ChebNetII与Transformer层，通过嵌入多种编码（拉普拉斯位置编码PE和随机游走结构编码SE）丰富节点信息，能够有效捕获基因间的长程依赖关系并感知图的拓扑结构。

研究人员从GEO数据库中获取了GSE41657和GSE31905两个微阵列数据集（均基于GPL6480平台），合并后共包含155个样本（包括腺瘤、结直肠癌和正常黏膜样本）。通过差异表达分析（DEGs）、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建、功能富集分析（GO和KEGG）等一系列生物信息学方法，并结合ChebTs模型的训练与预测，最终筛选出八个与结直肠“腺瘤-癌”转化密切相关的关键基因：FN1、CLDN2、IL-33、MMP1、STC2、IGFBP7、NOX4和SFRP1。

研究的重要意义在于：这些基因均与结直肠癌的总生存期（OS）显著相关，可能作为结直肠癌的诊断生物标志物。它们通过参与细胞外机制重塑、紧密连接破坏、炎症免疫调节、氧化应激以及Wnt信号异常等生物学过程影响患者预后，对预防腺瘤癌变具有重要意义。

三、关键技术方法概述

研究人员主要采用了以下几个关键技术方法：

1. 1.
   数据处理与差异表达分析：使用R语言中的sva、ComBat、limma和ggplot2包对来自GEO数据库的GSE41657和GSE31905数据集进行预处理（包括数据清洗、归一化、log转换和批次效应校正）及DEGs分析。
2. 2.
   PPI网络构建：从STRING数据库（版本12.0）获取蛋白质相互作用数据，保留综合评分大于0.4的互作关系，并使用Cytoscape软件进行可视化。
3. 3.
   ChebTs模型构建：提出结合ChebNetII（基于切比雪夫插值的图卷积网络）、Transformer层和注意力池化层的图神经网络模型。通过嵌入拉普拉斯位置编码（PE）和随机游走结构编码（SE）增强基因特征，在NVIDIA GeForce GTX 4080 GPU上使用PyTorch框架实现，采用5折交叉验证，AdamW优化器，学习率为1×10^-4，隐藏维度128，训练200个epoch。
4. 4.
   关键基因筛选与验证：利用模型生成的基因重要性分数排序筛选候选基因；使用GNNExplainer进行基因层面的可解释性分析；通过Kaplan-Meier Plotter进行生存预后分析；运用scTenifoldKnk R包进行虚拟敲除实验以评估基因扰动效应。

四、研究结果

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  DEGs分析与PPI网络构建：差异表达分析显示，正常黏膜与腺瘤组织之间有2392个显著失调基因（717个上调，1675个下调）；腺瘤与结直肠癌组织之间有228个显著基因（109个上调，119个下调）；正常黏膜与结直肠癌组织之间有2749个显著基因（1019个上调，1730个下调）。韦恩图揭示了64个在整个转化序列中持续失调的基因。PPI网络共形成1293个蛋白质节点和2423个相互作用关系。
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  评估指标：为评估模型预测关键基因的能力，采用了多层次评估框架，包括受试者工作特征曲线下面积（AUROC）、精确率-召回率曲线下面积（AUPRC）和F1分数。
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  基线比较实验：ChebTs在所有评估指标上均优于其他基线模型，F1分数达到0.8831，AUROC为0.9432，AUPRC为0.9593。结果表明，切比雪夫卷积神经网络在此背景下有效，且图结构信息与高阶特征的交互融合能有效提升分类性能。
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  消融实验：移除任一单一特征（注意力机制、PE/SE编码）均导致所有评估指标下降，证实了各组件（ChebNetII、Transformer分支和PE/SE编码模块）在模型中的协同作用和不可或缺性。
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  富集分析与功能注释：GO富集分析结果显示DEGs显著集中在细胞外基质（ECM）相关过程。KEGG通路富集分析揭示了与代谢紊乱、炎症调节和肿瘤微环境相关的通路，包括蛋白质消化吸收、AGE-RAGE信号通路和肌肉细胞骨架调节通路。
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  ChebTs在不同癌症类型中的关键基因预测性能比较：在肝癌和胰腺癌独立数据集上的测试表明，模型具有良好的稳定性和鲁棒性。在肝癌中，ChebTs识别的Top10基因中有7个（HOXA13、NPC1L1、TDO2、AKR1B10、APOF、ADH1B和CYP2C19）已被文献验证为诊断生物标志物；在胰腺癌中，6个基因（MUC17、MBOAT2、SLC6A14、MUC13、ANXA10和GALNT5）被鉴定为预后生物标志物。
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  基于GNNExplainer的基因可解释性分析：GNNExplainer分析显示，MMP1、STC2、NOX4和IL-33在两个阶段均持续上调，发挥致癌功能；SFRP1持续下调，发挥抑癌作用；CLDN2在正常到腺瘤阶段上调、腺瘤到癌阶段下调，可作为腺瘤特异性生物标志物；FN1和IGFBP7在腺瘤阶段下调、癌阶段上调，可作为预后生物标志物。相关性热图显示NOX4与MMP1呈显著正相关（r=0.50），SFRP1与STC2呈显著负相关（r=-0.25）。
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  验证：生存预后分析证实这八个基因均与总生存期显著相关。虚拟敲除实验显示，敲除每个基因均导致调控网络的显著扰动，其中敲除IL-33引发的下游效应最为广泛。共同靶基因热图分析揭示ZDHHC9在所有八个敲除组中均表现出显著差异表达，可能是癌变过程中的关键下游效应子。

五、讨论与结论总结

讨论部分指出，腺瘤到癌症的转变并非由单个基因突变驱动，而是多个基因在网络层面的协同失调所致。富集结果揭示了以ECM重塑为中心轴、炎症和TGF-β信号协同驱动结直肠癌恶性转化的分子网络。与现有聚焦于静态突变状态判别的方法相比，本研究强调了腺瘤到癌症的动态转变过程，旨在识别具有高恶性潜能的分子生物标志物，从而促进精准干预。研究也承认了样本量较小、缺乏体外实验证据等局限性，并计划在未来工作中利用斑马鱼DSS+AOM化学诱导法进行体内验证。

研究结论为：本研究提出的ChebTs模型整合了局部拓扑特征与全局注意力机制，成功筛选出八个与结直肠“腺瘤-癌”转化相关的关键基因（FN1、CLDN2、IL-33、MMP1、STC2、IGFBP7、NOX4和SFRP1）。这些基因通过参与ECM重塑、炎症免疫调节、氧化应激和Wnt信号异常等多种生物学过程协同驱动恶性转化，可能成为结直肠癌的诊断生物标志物，并对预防腺瘤癌变具有重要意义。