利用 qRT-PCR 与微生物组学监测 Dermatophagoides pteronyssinus 培养生长及其环境微生物影响

《PLOS One》：Genetic and microbiomics approaches allow the monitoring of the growth of Dermatophagoides pteronyssinus cultures and their environmental influences

Dermatophagoides pteronyssinus 在工业设施中培养，以生产用于过敏诊断和治疗性治疗的过敏原提取物。在这些设施中，应监测螨生长和生产，并且必须进行详尽的质量控制，以收获螨、达到最佳扩增并避免潜在微生物污染。在本研究中，研究人员探索了遗传学方法，以监测五个独立的 D. pteronyssinus 培养物的生长。进行了微生物学研究，以表征培养过程中微生物群落的演变。最后，研究人员设计了 qRT-PCR（定量实时 PCR，quantitative real-time PCR）应用，以定量培养物中的螨种群。研究人员的微生物组研究显示存在非致病细菌且不存在革兰阴性（Gram-negative）细菌。尽管五个培养物开始时微生物组属存在变异性，但随着螨生长进展，培养批次之间的微生物组组成趋于更均一。具体而言，Staphylococcus sp.、Virgibacillus sp. 和 Malassezia sp. 似乎是参与培养进程的最重要分类群。总之，研究人员开发了一种用于定量和监测螨培养物的特定方法，该方法可用于建立客观的收获螨方法，以制造标准化过敏原提取物。此外，研究人员提供了螨与其共生微生物之间关系的全面描述。

Dermatophagoides pteronyssinus（屋尘螨）是全球主要致敏螨，可产生多种过敏原，引起鼻结膜炎、哮喘并参与过敏性皮肤病。过敏原免疫治疗（allergen immunotherapy, AIT）是目前唯一对因治疗，需反复给予递增剂量的过敏原提取物，随后维持，可获得长期临床获益。过敏原提取物来自天然来源，螨在制药企业内按良好生产规范（good manufacturing practices, GMP）大规模培养。螨培养具有潜伏期、指数生长期和最大种群等典型模式，确定生产持续时间十分关键。传统上由有资质人员监测螨生长，但缺乏客观量化个体数量的方法。定量实时 PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）已用于环境样本微生物定量和屋尘中螨种鉴定，但尚未用于监测螨生产。培养需控制温度、相对湿度和饲料等，但批次间仍有变异；高温高湿可加速螨生长也利于真菌，革兰阴性（Gram-negative）菌可产生内毒素（endotoxin）污染培养物。传统培养法只反映可培养微生物，不能反映整个微生物组（microbiome），螨与共生微生物关系及群落动态尚未完全阐明。故研究人员评估五个 D. pteronyssinus 培养物，监测细菌和真菌类群，探索 qRT-PCR 监测螨生长，确定培养前不同培养基（culture medium, CM）批次微生物群落，分析外部和内部微生物谱并与螨生长相关。

研究人员在 LETI Pharma（Madrid, Spain）设施培养五个独立 D. pteronyssinus 培养物，来源于五个不同 CM 批次，培养 27–34 天。结果显示 qRT-PCR 可监测培养进程，微生物组以非致病菌为主、无革兰阴性菌，随生长趋于均一，Staphylococcus sp.、Virgibacillus sp. 和 Malassezia sp. 与培养进程最相关。研究意义在于为客观收获螨、制造标准化过敏原提取物提供方法，并描述螨与共生微生物关系。

关键技术方法概括（不超过250字）：五批独立培养物来源于 LETI Pharma（Madrid, Spain）设施，每培养 350 g，起始为 175 g 接种培养物和 175 g 培养基；五批培养基来自同一供应商不同批次，使用前 -20°C 48 h。培养 27–34 天，持续监测温度和湿度。在培养第1天、第15天和最终日采样。直接计数由两名训练操作员独立计数取平均，以每克培养物螨数表示。qRT-PCR 在 LETI Pharma R&D 与 Centro de Biología Molecular Severo Ochoa（CSIC-UAM）两个中心独立检测，TaqMan 探针/引物扩增，读取 Cq（cycle threshold，循环阈值）。主要过敏原 Der p 1 和 Der p 2 用 ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定）定量。微生物组分析 35 份样本，包括内部、外部和 CM，扩增 16S rRNA 基因与 ITS（internal transcribed spacer，内转录间隔区）并测序；统计分析包括相关、双因素方差分析（two-way ANOVA）、PCoA（principal coordinate analysis，主坐标分析）和 PERMANOVA（permutational multivariate analysis of variance，置换多元方差分析）等。

研究结果：

D. pteronyssinus growth：通过直接计数和 qRT-PCR 研究五批螨生长。培养无污染物。Culture 1 生长快而持续，最终最高 181,783 mites/g；Culture 2 为 146,226 mites/g；Culture 5 前15天快、后慢；Culture 3 和4 生长慢且最低，分别为 99,434 和 106,865 mites/g。双因素方差分析显示时间显著影响螨种群，占总方差57.5%，培养类型不显著。qRT-PCR 中 Culture 1 Cq 最低，比开始降低 1.45 循环；Culture 5 Cq 变化最大 3.07；Culture 3 和4 最终 Cq 降低 0.90 和 0.95。种群倍增增加与 Cq 降低超过 1.45 循环相关。Cq 与螨种群显著负相关 r=-0.69, p=0.0443。以 Cq 为因变量，双因素方差分析显示时间和培养类型均显著。Culture 1 和4 结束时 Der p 1 最高，Der p 2 趋于相似。

Microbiome diversity in D. pteronyssinus cultures：通过 16S rRNA 和 ITS 测序研究微生物组多样性。16S rRNA 非嵌合序列为 144,712–326,881，ITS 非嵌合序列数为 72,095 和 68,646。获得 2,195 个 16S ASV（amplicon sequence variant，扩增子序列变体），917 个 ITS ASV。细菌属 Firmicutes、Actinobacteria 和 Proteobacteria；真菌属 Ascomycota 和 Basidiomycota。细菌最常见 Staphylococcus sp.，其次 Virgibacillus sp.、Kocuria sp.、其他、未分类、Streptomyces sp.、Cutibacterium sp.。真菌最常见 Aspergillus sp.，其次 Cryptococcus sp.、Malassezia sp.、Cladosporium sp.。层次聚类和 PCoA 显示细菌样本分两个主要簇：Culture 1–2 与 Culture 3–5，CM 独立分支；按批次的 PCoA 显著（PERMANOVA, F=12.682, R²=0.636, p=0.001），按来源和时间无明确聚类。真菌整体较均一，按批次和来源有中度聚类（F=2.169, R²=0.243, p=0.024；F=4.984, R²=0.237, p=0.002），按时间无聚类，说明真菌群落跨发育阶段相对稳定。

Microorganisms in culture media batches：通过培养前 CM 批次分析，CM 细菌无保守属；Cutibacterium sp. 和“其他属”最常见，其次 Staphylococcus sp. 和 Virgibacillus sp.。CM3 中 Cutibacterium sp. 最高，CM5 中 Staphylococcus sp. 最高，且显著。真菌中 Cryptococcus sp. 在 CM1 和 CM2 最丰富，Malassezia sp. 在 CM4 最丰富，Aspergillus sp. 在 CM5 最丰富。CM 批次间存在显著差异。

Changes in microbial communities during mite culture growth：通过比较培养进程内外微生物。外部微生物组比内部更均一，批次间趋于相似。外部细菌常见 Staphylococcus sp. 和 Virgibacillus sp.；内部除二者外还有 Kocuria sp. 和 Streptomyces sp.。外部真菌以 Aspergillus sp.、未分类组和 Cryptococcus sp. 最丰富；内部 Malassezia sp. 相关。培养结束时外部细菌批次间相似，内部细菌随培养和批次变化大。Culture 4 和5 结束时内部细菌多样性模式相似。Culture 2 的 Streptomyces sp. 和 Staphylococcus sp. 丰度最高，Culture 3 唯一具有显著 Cutibacterium sp.。真菌方面，Culture 3 最终外部样本有 Cryptococcus sp.；其余结束主要为 Aspergillus sp. 和未分类。Culture 4 的 Aspergillus sp. 较其他更常见。内部真菌仅 Culture 5 结束时无 Malassezia sp.，Culture 3 无法分析。

Relationship between microbial communities and mite growth：通过关联微生物群与生长。Culture 4 和5 生长模式相似，内外样本共享相同细菌类群。Culture 1 螨生长率最高，外部细菌中“未分类”和 Virgibacillus 丰度最高；Culture 2 内外 Streptomyces 最高，外部 Staphylococcus sp. 最高。Culture 3 螨生长最低，是唯一内部有 Cutibacterium sp.、外部有 Cryptococcus sp. 的培养。

讨论部分总结：讨论认为培养条件、原材料和终产物质量相关。qRT-PCR 可能为最佳及成本有效替代，已用于屋尘螨和仓储螨定量。本研究成功监测五培养物，Cq 与生长大致一致；Culture 1、2、4、5 的 r 为 -0.88 至 -0.99，Culture 3 r < -0.5，可能因生长慢和最终种群低。Cq 受时间和培养类型显著影响，说明其反映总体时间趋势，又受 DNA 提取效率、样本组成或扩增变异影响，故 qRT-PCR 应作为补充直接种群测量的可靠实用工具，而非直接等同。支持用于过程监测和潜在认证，减少时间、主观解释、提高产量，但需更大样本。微生物群与培养进程相关。限制是培养基确切组成保密，批次间有差异；CM1、2、3 细菌和真菌差异大于4、5；随生长微生物组更均一。最终加工包括 0.2-mM 过滤使提取物无菌。细菌为非致病、少数优势类群，仅三主要门，与既往研究一致；Staphylococcus sp.、Virgibacillus sp.、Kocuria sp. 常见。革兰阴性菌比例不显著，但内毒素可能影响提取物。细菌谱差异可解释生长差异。PCoA 中 Culture 1 和2 最终螨数最高，内外细菌差异最显著，涉及 Virgibacillus sp.、未分类、Staphylococcus sp.、Streptomyces sp. 比例。Staphylococcus sp. 与环境样本螨密度正相关，内部 Virgibacillus sp. 与螨密度负相关。Cutibacterium sp. 仅在 Culture 3 内部，首次在螨培养中观察到。真菌批次间差异非显著，Aspergillus sp. 最丰富并与成熟培养和培养年龄增加相关；Malassezia sp. 为内部持续共生。Der p 2 和微生物组成随生长更均一；Culture 1 和4 的 Der p 1 最高，二者内部 Staphylococcus 和 Malassezia 水平最低。需更多研究共生肠道微生物如何影响螨过敏原表达，尤其 Der p 1、Der p 2、Der p 23。

研究结论部分翻译：总之，研究人员证明 qRT-PCR 作为监测螨生长的有前景工具，未来可作为控制机制以改善和优化工业培养。此外，研究人员描述了 D. pteronyssinus 培养物微生物群的变化，作为影响螨生长、发育和繁殖的环境因素。Staphylococcus sp.、Virgibacillus sp. 和 Malassezia sp. 是与培养进程相关的最丰富分类群。考虑到这些螨培养物是用于生产过敏诊断和治疗过敏原提取物的原材料，这些非致病微生物的发现具有医学意义，有助于更深入了解和控制螨生长。本研究的一个实际应用可能是实施标准筛选方法，以选择最佳培养基批次，并基于存在的共生微生物监测螨生长。