尿嘧啶驱动的ROS信号与幼虫TrpA1-B神经元激活是启动成年果蝇味觉对细菌肽聚糖反应所必需的

《PLOS Biology》：Uracil-driven ROS signaling and larval TrpA1-B neuron activation are required for priming the adult Drosophila gustatory response to bacteria

　　

动物通过其感觉系统感知周围环境。这些系统依赖基因组编码的明确神经回路和受体蛋白，但也可受内部生理条件或外源因素调节。研究人员先前已表明，幼虫肠道中存在某些病原细菌可改变由这些幼虫羽化而成的成虫对细菌肽聚糖(peptidoglycan, PGN)识别的特异性。然而，负责接收并转导该信号的细菌信号性质以及宿主细胞和分子仍未知。研究人员的鉴定尿嘧啶(uracil)为负责该启动(priming)的细菌代谢物，并证明该效应由幼虫肠道中Duox依赖性活性氧(reactive oxygen species, ROS)产生所介导。研究人员进一步表明，在幼虫端器(terminal organ, TO)中表达Gr66a的神经元内特异性表达TrpA1同工型是成虫反应所必需的。总之，这些发现揭示尿嘧啶是细菌线索，Duo/ROS信号与TrpA1/Gr66a模块是连接幼虫肠道微生物信号与宿主整合，进而影响成虫感觉系统调节的关键介质。

研究背景与问题：动物在自然环境中与细菌、病毒和真菌共存，检测微生物威胁并作出防御反应对生存重要。果蝇中，细菌细胞壁成分肽聚糖(peptidoglycan, PGN)可被成虫味觉神经元识别并引发厌恶。研究人员此前发现，幼虫肠道中存在某些病原细菌可改变成虫对细菌PGN识别的特异性；无菌(axenic)幼虫发育而来的成虫失去对PGN的厌恶反应，而向无菌幼虫重新引入Levilactobacillus brevis(L. brevis)而非Lactiplantibacillus plantarum可恢复该反应。由此提出问题：何种细菌信号负责启动(priming)？哪些宿主细胞和分子接收并转导该信号？幼虫期微生物信息如何经变态影响成虫感觉系统？

研究人员开展的研究、结论与意义：研究人员通过无菌/单关联(monoassociation)幼虫饲养、成虫喙伸展反射(proboscis extension reflex, PER)味觉测试、幼虫钙成像、GAL4/UAS及LexA/LexAop遗传操作等，鉴定尿嘧啶(uracil)为细菌启动信号，且其必要且充分。尿嘧啶在幼虫肠道触发Duox依赖性活性氧(reactive oxygen species, ROS)产生，尤其是H₂O₂相关信号。TrpA1的B、C、E同工型而非A、D参与启动；TrpA1-B在Gr66a⁺端器(terminal organ, TO)前部神经元中表达，是该过程必需且足够的节点。条件化培养基实验表明，尿嘧啶处理幼虫释放Duox依赖的可扩散信号，可激活未暴露幼虫的TrpA1-B⁺神经元。自由取食实验进一步验证成虫回避PGN依赖幼虫微生物暴露和TrpA1。该研究揭示尿嘧啶-Duox/ROS-TrpA1/Gr66a轴连接幼虫肠道微生物信号与成虫感觉调节，具有重要生理与生态意义。

关键技术方法：以w¹¹¹⁸(w^?)为参照，使用无菌胚胎、单关联幼虫及5–7日龄雌成虫；细菌包括L. brevis、Erwinia carotovora(Ecc15)及尿嘧啶释放突变体Ecc15Δ4、Ecc15pyrE::Tn5。主要技术为：PER评估味觉反应；幼虫钙成像(GCaMP7s)检测神经元活动；GAL4/UAS与LexA/LexAop进行细胞特异RNA干扰(RNA interference, RNAi)、过表达及挽救；Tub-GAL80^ts实现阶段特异操作；TrpA1同工型敲入(knock-in, KI)与敲除(knock-out, KO)；条件化培养基；Amplex Red与L-012检测ROS；双选择自由取食。

研究结果：
不释放尿嘧啶的突变细菌不再能够启动幼虫。研究人员将无菌幼虫暴露于活/死L. brevis、上清、Ecc15及其尿嘧啶释放突变体、纯尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶，再用PER检测成虫对蔗糖与蔗糖+PGN的厌恶。活L. brevis必要且足够；热杀细菌和上清不能启动；Ecc15Δ4和Ecc15pyrE::Tn5丧失启动能力；1 mM尿嘧啶足以启动；胞嘧啶和胸腺嘧啶不能模拟。24 h幼虫暴露于尿嘧啶或Ecc15不能启动，关键窗口早于幼虫孵化后24 h。钙成像显示，仅尿嘧啶暴露幼虫来源成虫的ppk23⁺神经元对PGN响应。

肠上皮细胞产生ROS是幼虫启动所必需。通过mex-GAL4在肠上皮细胞RNAi降低Duox，成虫对PGN的厌恶消失。Tub-GAL80^ts阶段特异实验表明，Duox活性在幼虫期而非成虫期必需。尿嘧啶暴露24 h幼虫中H₂O₂升高；肠上皮过表达过氧化氢酶(catalase)或添加维生素C抑制启动。外源H₂O₂补充不足以启动。

TrpA1的B、C、E同工型而非A、D参与幼虫启动。利用TrpA1 KI/KO，B-KI、C-KI、E-KI如野生型；A-KI、D-KI如TrpA1-KO。E-KO、BC-KO、AD-KO仍响应PGN；BCE-KO唯一受损，说明B、C或E任一存在足以启动，A、D不必要。

TrpA1 B、C、E同工型在某些前部神经元共表达。GAL4报告显示，B、C、E共表达于TO最前部单个可能苦味神经元、背/腹器官少数神经元、BLP脑神经元和肠道肠内分泌细胞(entero-endocrinal cells, EEC)；C、E也表达于腹神经索和C4da幼虫伤害感受神经元，而B不表达于这些部位。TrpA1-B-GAL4表达域最局限。RNAi证明幼虫期而非成虫期在TrpA1-B⁺细胞失活TrpA1阻断启动。Gr66a-LexA与TrpA1-B-GAL4共定位一个前部Gr66a⁺神经元。在Gr66a⁺细胞表达TrpA1-B足以挽救TrpA1突变体启动缺陷，TrpA1-A不能。Gr39a.b⁺细胞也显示类似结果，且排除EEC为必需。

TrpA1-B阳性TO神经元被H₂O₂激活。钙成像显示，Gr66a-GAL4/UAS-GCaMP幼虫前部三个神经元中仅一个对1% H₂O₂强响应，该神经元也对奎宁响应。TrpA1-B-GAL4神经元可被H₂O₂激活，细胞特异RNAi TrpA1后响应消失。奎宁暴露不足以启动幼虫。

尿嘧啶诱导Duox依赖信号激活na?ve幼虫TrpA1-B⁺神经元。条件化培养基实验中，抗生素饲养幼虫置于水或1 mM尿嘧啶3 h，取介质加到未暴露的TrpA1-B-GAL4/UAS-GCaMP7s幼虫。仅尿嘧啶处理幼虫的条件化介质引起TrpA1-B⁺前部神经元钙升高；供体肠上皮Duox敲低后该活动消失。L-012检测显示尿嘧啶增加幼虫ROS，维生素C消除该信号。说明尿嘧啶产生Duox依赖可扩散信号，可能为ROS如H₂O₂，激活na?ve接收者TrpA1-B⁺神经元。

自由取食实验确认PGN回避并揭示其依赖幼虫微生物暴露和TrpA1。双选择染色琼脂实验中，5–7日龄雌成虫可自由取食。对照偏好1 mM蔗糖高于蔗糖+PGN，偏好指数(preference index, P.I.)>0.8；幼虫期抗生素饲养降低PGN回避，P.I.<0.55；TrpA1-KO不区分两种食物，P.I.=0.51；TrpA1-BCE-KO不区分，而AD-KO仍可区分，说明B/C/E必要，A/D可缺失。

讨论与结论：研究人员总结，尿嘧啶是细菌启动信号且必要充分；仅尿嘧啶分泌能力不同的菌株启动能力不同。ROS作为第二信使参与；TrpA1-B/Gr66a⁺ TO前部神经元必需，TrpA1-B而非A足以挽救。肠道EEC虽表达TrpA1，但遗传分析排除其为必需细胞。Duox在肠道必需，过氧化氢酶过表达阻断启动，H₂O₂可能为主要ROS。然而外源H₂O₂不足以启动，可能因未重现肠道内局部瞬时ROS，或ROS促进脂质氧化生成次级亲电代谢物如4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal, 4-HNE)进而激活TRPA1。条件化培养基显示，尿嘧啶处理幼虫释放Duox依赖可扩散信号，可激活na?ve幼虫TrpA1-B⁺神经元，提示肠道来源ROS或衍生物可作为个体间线索。跨变态传递机制仍未解决，研究人员提出特定神经回路持续、TrpA1-B⁺神经元作为候选节点、转录或表观重编程以及分布式记忆等非互斥可能。最简约模型为：Duox依赖ROS信号启动局部亲电代谢物形成并作用于感觉通路，同时平行的回路和表观机制在变态过程中稳定所得状态。研究结论翻译：总之，这些发现揭示尿嘧啶是细菌线索，Duox/ROS信号与TrpA1/Gr66a模块是连接幼虫肠道微生物信号与宿主整合到随后成虫感觉系统调节的关键介质。