甲基化鼠李糖脂衍生物的合成及其与光敏剂甲苯胺蓝O (TBO)的协同抗菌作用

《Food and Bioproducts Processing》：Synthesis of Methylated Rhamnolipid Derivatives and Their Synergistic Antibacterial Effect alongside the Photosensitizer Toluidine Blue O (TBO)

　　

摘要

细菌耐药性日益构成重大挑战，亟需创新性的抗菌解决方案。本研究评估了甲酰胺修饰槐糖脂（RLs-MMA）的抗菌活性。RLs-MMA首先通过甲胺与槐糖脂羧基的酰胺缩合反应合成。利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、核磁共振（NMR）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析确认了衍生物的结构。RLs-MMA对革兰氏阳性菌表现出显著强效作用。针对枯草芽孢杆菌，其最小抑菌浓度（MIC）低至16  mg/L。该数值相比双槐糖脂（256  mg/L）提高了16倍，相比单槐糖脂（64  mg/L）提高了4倍。RLs-MMA对金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的MIC值在64–128  mg/L范围内，显著低于未修饰槐糖脂（≥256  mg/L）的数值。RLs-MMA单独对革兰氏阴性菌无效（MIC >512  mg/L）。然而，将其与光敏剂 toluidine blue O（TBO）联合并在红光照射下使用，协同作用显著。棋盘法实验显示，大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抑菌分数指数（FICi）值分别<0.375和<0.25。机制研究表明，RLs-MMA可破坏细菌膜完整性，促进胞内TBO摄取，并增强光动力产生的活性氧（ROS）。这种膜通透性增强与光动力相结合的策略可克服革兰氏阴性菌的外膜屏障。

引言

细菌对人类生命和生态环境至关重要（Buonocore等，2023）。尽管已知细菌中仅有少数为致病性，但细菌感染仍然是重大的公共卫生负担（Clark等，2016）。其中，革兰氏阴性菌（如大肠杆菌和铜绿假单胞菌）由于其独特的外膜结构，对多种抗生素具有内在耐药性（Chen等，2024）。由这些细菌引起的感染难以治疗且与高死亡率相关，持续构成抗感染治疗领域的严峻挑战（Saxena等，2023）。因此，寻找新型抗菌分子，尤其是针对革兰氏阴性菌的分子，已成为紧迫的全球公共卫生问题（Saxena等，2023）。

近年来，抗菌光动力疗法（APDT）作为一种有效的抗菌方法受到关注（Huang等，2025）。其作用机制主要依赖于光敏剂在细菌细胞膜或细胞内靶点的积累（Yang等，2020）。当受到光照时，这些物质产生活性氧（ROS），如具有细胞毒性的单线态氧（¹O₂），对细菌造成不可逆损伤（Yang等，2020）。与传统抗菌疗法相比，APDT具有多重优势。首先，ROS可作用于多种生物分子，产生多靶点效应，从而降低诱导特定细菌耐药的可能性（Huang等，2026）。其次，该疗法允许局部治疗，从而避免全身用药带来的副作用（Zhang等，2019）。此外，APDT对多种细菌具有广谱抗菌活性（Galstyan和Dobrindt，2018）。TBO是一种经典的吩嗪鎓类光敏剂，属于与亚甲基蓝同一家族，自20世纪以来在光动力应用中已有成熟的使用历史（Gu等，2024）。作为经典的吩嗪鎓染料，TBO在620–660  nm范围内具有强吸收，并在光照激活下以高量子产率产生¹O₂（Gu等，2024）。然而，尽管其光动力性质良好，TBO是一种亲水性光敏剂，难以穿透疏水性细菌细胞膜。这导致其在细胞内空间的积累量低，从而限制了抗菌效果（Boccalini等，2017）。这一问题在革兰氏阴性菌中尤为突出，其外膜由脂多糖、脂蛋白和孔蛋白组成，形成了更强的通透性屏障，进一步阻碍了光敏剂的渗透（Fivenson等，2023）。

最近的研究专注于评估APDT与膜通透性增强剂的组合以增强抗菌活性（Fabio等，2023）。在此背景下，十二烷基硫酸钠被证明可以增强亚甲基蓝介导的APDT对牙龈卟啉单胞菌的效力（Tortamano等，2020）。Zhao等（Zhao等，2021）发现表面活性素可促进亚甲基蓝在铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌中的积累，提高APDT效率。此外，表面活性剂与APDT联合使用已被证明可产生显著协同作用，甚至在低于最小抑菌浓度（MIC）的浓度下亦然。其中阳离子和非离子表面活性剂表现出最大的协同效应（Tardivo等，2005）。

槐糖脂是一种糖脂类生物表面活性剂，由于其两亲性结构，可嵌入细菌细胞膜的磷脂双分子层中（Bhattacharjee等，2016；Cerqueira dos Santos等，2024；Jovanovic等，2019）。这种作用会破坏膜的有序性，导致膜完整性丧失和通透性增加。这一变化导致胞内物质泄漏，从而促进抗菌作用（Haba等，2003）。槐糖脂已被证明可以增强靶向细胞内代谢的抗生素渗透细菌的能力。例如，与乳酸链球菌素联用时，对单核细胞增生李斯特菌表现出强协同作用（FICi < 0.2）（Magalh?es和Nitschke，2013）。此外，槐糖脂与克林霉素、林可霉素或利奈唑胺联合针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）使用可产生协同增效（Gdaniec等，2022；Kaskatepe和Ozturk，2023）。总体而言，槐糖脂与各种抑菌剂联合使用时，对革兰氏阳性菌表现出显著的协同活性（Chen等，2019）。然而，它们对具有更复杂外膜结构的革兰氏阴性菌的膜通透性增强作用被证明无效（Chen等，2019）。这一局限性削弱了它们有效协助抗菌药物胞内递送的能力（Lei等，2022）。

为克服这一局限性，研究人员转向槐糖脂的合理化学修饰以增强其生物活性。Aleksic等（Aleksic等，2017）通过酰胺化反应将苄胺、哌啶和吗啉连接到双槐糖脂上，显著降低了针对金黄色葡萄球菌的MIC，从>500  mg/L降至62.5  mg/L。进一步通过引入碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）或其他正电性基团的修饰实现（Ramos da Silva等，2019），增强了与细菌细胞膜的静电相互作用，将针对MRSA的MIC降至16  mg/L以下，同时保持合理的可生物降解性（Ramos da Silva等，2019）。

鉴于革兰氏阴性菌的外膜限制了亲水性光敏剂的胞内递送，我们开发了甲酰胺修饰槐糖脂作为膜通透性增强剂以促进TBO的摄取。该组合在光照下预计可产生强效协同杀菌活性。

章节摘要

材料

胰蛋白胨购自上海Sangen生物科技有限公司。酵母提取物购自上海Aladdin生化科技有限公司。大豆油（食品级）购自当地超市。用于制备培养基的无机盐为分析纯，购自国药化学试剂有限公司（上海）。有机溶剂同样为分析纯，购自南京化学试剂有限公司。

槐糖脂及其衍生物的鉴定

表面活性剂通常通过使细菌细胞膜通透化来发挥杀菌作用，而增强疏水性有助于其插入细胞膜（Cui等，2024）。由于羧基具有强烈的亲水性，本研究通过甲酰胺修饰将甲胺连接到槐糖脂的羧基上，显著增强了槐糖脂的疏水性。由于天然槐糖脂以双槐糖脂和

结论

本研究成功合成了甲基化槐糖脂衍生物（RLs-MMA），并利用FTIR、NMR和LC-MS分析确认了其结构。据此，该修饰显著提高了槐糖脂对革兰氏阳性菌的抗菌活性，并提供了更宽的pH稳定性。虽然RLs-MMA单独对革兰氏阴性菌表现出有限的抑制活性，但将其与TBO联合在红光照射下使用可产生强效协同抗菌效果。

CRediT作者贡献声明

赵梦千：撰写初稿、验证、方法论、形式分析、数据整理、概念化。龙旭威：撰写审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化。杨志红：资金获取、概念化。尹健：监督、资源、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本论文中报告的工作。

致谢

作者衷心感谢中央高校基本科研业务费（编号30922010901）和南通市科技计划项目（JC2024053）对本研究的资金支持。

赵梦千|尹健|杨志红|龙旭威

南京理工大学环境与生物工程学院，南京，210094，中国