《Food and Chemical Toxicology》：An Overview of
In Vitro Genotoxicity Testing Strategies for Fragrance Materials: Addressing False Positives and Advancing Non-Animal Approaches
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摘要欧盟对化妆品成分活体基因毒性测试的禁令（指令2003/15/EC），随后科学委员会对消费者安全的第7次修正案，创建了对稳健的非动物基因毒性测试策略的迫切需求。标准法规体外实验——包括Ames试验、体外微核试验和染色体畸变试验——容易产生高比例的误导性阳性结果（对于化妆品成
摘要
欧盟对化妆品成分活体基因毒性测试的禁令（指令2003/15/EC），随后科学委员会对消费者安全的第7次修正案，创建了对稳健的非动物基因毒性测试策略的迫切需求。标准法规体外实验——包括Ames试验、体外微核试验和染色体畸变试验——容易产生高比例的误导性阳性结果（对于化妆品成分高达93%），主要是因为缺乏足够的II相代谢能力。本综述描述了一种分层、机制导向、完全体外的测试策略，该策略整合了：(1) ToxTracker试验，一种用于机制后续研究的绿色荧光蛋白（GFP）报告干细胞平台；(2) 3D重构皮肤微核（RSMN）试验，提供生理相关的皮肤暴露模型；(3) 鸡蛋基因毒性试验（CEGA）和母鸡卵微核诱导试验（HET-MN），利用胎鸡系统的代谢能力；以及(4) 使用OASIS TIMES的计算机模拟代谢预测。提供了建议的决策流程图。两个案例研究，2-辛烯-4-酮和对甲氧基肉桂醛，说明了该策略如何解析模糊的体外发现，并区分真正的基因毒性危害与非生物相关的阳性结果。
引言
化妆品和香料安全评估的法规环境经历了重大转变，在欧盟禁止对化妆品成分进行活体基因毒性测试（指令2003/15/EC）之后。由于这一转变，需要开发和验证稳健的非动物测试策略，以区分真正的基因毒性危害和标准法规批准的体外基因毒性试验中经常遇到的假阳性。
研究表明，化妆品成分的体外基因毒性测试中高达93%的阳性结果可能不具有生物学相关性，导致额外测试和有价值的化合物丧失（Ates等人，2014）。在欧盟动物测试禁令之前，对模糊体外结果的法规后续依赖于活体试验，如啮齿动物骨髓微核试验和组织彗星试验。这些活体方法不再被允许用于评估化妆品成分，这推动了对完全体外策略的需求，如本综述所述。
为应对这一挑战，一种分层测试策略应运而生，该策略结合了机制性、代谢能力和生物学相关模型。其中，ToxTracker试验、3D重构皮肤微核（RSMN）试验和鸡蛋基因毒性试验（CEGA）已显示出作为动物替代品的巨大潜力。体外断裂诱导性/非整倍体性（染色体畸变/体外微核试验）和Ames试验仍然是法规工具箱的基础，并在分层策略的背景下进行讨论。
理解化合物为什么在标准体外试验中产生阳性结果对于解释其生物学相关性至关重要。常见的作用机制包括：
直接DNA损伤：亲电化合物或反应性代谢物形成DNA加合物，诱导链断裂或导致交联，构成真正的基因毒性，可在多个试验平台上检测到（Kirkland等人，2005）。
氧化应激：许多化妆品和香料材料，特别是α,β-不饱和羰基化合物，在体外产生反应性氧物种（ROS），导致氧化应激作为结果产生的间接DNA损伤，而非直接基因毒性（Srinivas等人，2018）。然而，这些效应通常在代谢能力的测试系统中减弱，在这些系统中活跃的谷胱甘肽和葡萄糖醛酸化途径使反应性中间体解毒，这为体内基因毒性发现缺乏重复性提供了机制性解释（Janzowski等人，2003；Thakkar等人，2023）。
细胞毒性相关假象：在高浓度下，非特异性细胞毒性可产生与基因毒性无关的人为微核或染色体畸变。标准法规指南规定了细胞毒性阈值（例如，≥55%相对细胞计数）以减轻这一问题（OECD 487）。
标准体外系统的局限性：标准体外试验缺乏关键代谢途径，特别是II相反应如葡萄糖醛酸化和其他硫酸结合。缺乏硫酸转移酶活性是一个重大局限，因为某些在体内通过硫酸化解毒的化合物可能在标准体外系统中出现假性基因毒性。在选择后续试验时这是一个重要考虑因素（G?tz等人，2012；Ates等人，2014）。
ToxTracker试验利用绿色荧光蛋白（GFP）报告小鼠胚胎干细胞系来识别基因毒性机制，如DNA损伤、氧化应激和蛋白质错误折叠。
在Thakkar等人（2023）的一项研究中，ToxTracker被应用于4种在标准体外微核试验中呈阳性但在体内和3D皮肤试验中均呈阴性的香料材料。ToxTracker成功识别出氧化应激为4种物质中3种的可能作用机制，支持其在机制后续测试中的效用，并指导选择合适的非动物试验。
补充机制性考虑因素，并且适用于经皮途径测试的物质，3D RSMN试验提供了生理相关模型，用于评估皮肤暴露的基因毒性潜力。在22种香料材料的全面评估中，RSMN试验与体内微核结果显示了100%的一致性，有效地解决了体外试验产生的误导性阳性结果。RSMN的相关性进一步得到了加强，因为皮肤暴露代表消费者对香料物质的主要暴露途径。
CEGA和HET-MN试验，基于受精鸡蛋，提供了评估DNA损伤和微核形成的代谢能力系统。Thakkar等人（2024）证明了CEGA可以检测到DNA加合物和链断裂，而HET-MN可靠地估计了断裂诱导性。值得注意的是，对甲氧基肉桂醛CEGA结果的差异通过谷胱甘肽前体预处理得到了解决，这突出了代谢环境在基因毒性评估中的重要性。
这些研究共同支持了一种精炼的、机制导向的基因毒性测试策略，该策略整合了ToxTracker、CEGA/HET-MN和RSMN试验。这种综合方法为香料材料评估提供了一种稳健的动物替代基因毒性测试框架。
章节片段
建议的决策流程图
图1展示了香料材料完全体外基因毒性评估的分步决策算法。策略按以下进行：
3D RSMN试验
RSMN试验使用EpiDerm? 3D人皮肤模型进行。组织被暴露于溶解在丙酮中的测试物质中，具有2个处理持续时间（48小时和72小时）。细胞毒性通过相对存活细胞计数和双核指数评估。微核在双核细胞中评分，遵循为3D组织改编的OECD测试指南487方案。完整的方案细节见Dahl等人（2011）和Thakkar等人（2022）。
ToxTracker试验
ToxTracker试验使用了6...
案例研究1：2-辛烯-4-酮
2-辛烯-4-酮（一种α,β-不饱和酮）的断裂诱导潜力最初使用人外周血淋巴细胞的体外微核试验评估。观察到具有统计学意义的、剂量依赖性的微核频率增加（阳性结果）。当在ToxTracker中测试时，2-辛烯-4-酮在9.8–39.4 μg/mL浓度下，无论是否有S9，均导致氧化应激报告因子的显著诱导（Srxn1-GFP和Blvrb-GFP）。Btg2-GFP的激活...
讨论和新兴体外基因毒性策略总结
传统的体外基因毒性试验工具箱——通常包括Ames试验、体外微核试验和染色体畸变试验——长期以来一直是化学品安全评估的基石。然而，这些试验的局限性越来越被认识到，特别是在化妆品和香料材料的背景下，其中法规限制禁止动物测试（欧盟指令2003/15/EC）。
最具挑战性的问题之一是高比例的误导性...
结论
当前的仅体外试验工具箱导致显著更高比例的误导性和生物学非相关结果。使用全新的动物替代、仅体外试验工具箱（见建议流程图，图1）可能有助于创建更可靠和生物学相关的基因毒性化学品检测。该策略结合了ToxTracker用于机制后续、3D RSMN试验用于皮肤途径相关性、以及CEGA/HET-MN用于代谢能力确认...
CRediT作者贡献声明
Danielle Botelho：写作 – 审阅与编辑。Yax Thakkar：写作 – 初稿。Anne Marie Api：写作 – 审阅与编辑、监督
未引用参考文献
Eder等人，1990；欧盟；Janzowski等人，2003；Kirkland和Müller，2000；Kumar等人，2021；Rollins等人，1981；Srinivas等人，2019；Tukey和Strassburg，2000。
Yax Thakkar|Danielle Botelho|Anne Marie Api
