基于酚类聚焦非靶向UHPLC–IM–QTOF-MS代谢组学的苏格兰蜂蜜季节相关化学特征解析

《Food Chemistry》：Phenolic-focused untargeted ion mobility LC-MS metabolomics reveals season-associated chemical signatures in Scottish honey

　　

蜂蜜真实性因产地错误标注、掺混和产品改造而受损，削弱了可追溯性和消费者信任。为解决此问题，研究人员开发了一种以酚类化合物为重点的非靶向超高效液相色谱–离子迁移–四极杆飞行时间质谱（UHPLC–IM–QTOF-MS）工作流程，用于采用低溶剂提取方法和碰撞截面辅助注释（CCS-SA）对苏格兰蜂蜜进行表征。对39个样品进行分析，包括苏格兰石楠蜜、春季蜜和夏季蜜以及市场相关比较样品，以研究与产地、季节和产品类型相关的组成变异。该工作流程产生了稳健的、经过质量控制的数据特征集，并具有强稀释线性；同时，精确质量、保留时间、MS/MS和碰撞截面（CCS）的整合提高了标志物注释的置信度。蜂场内部配对比较提供了稳健证据，表明春季蜜和夏季蜜具有不同的季节相关化学特征，石楠蜜则呈现为化学上独特的类别。探索性分析还表明苏格兰与非苏格兰蜂蜜之间存在差异，以及与掺混和浸渍相关的组成变化。由于若干比较组较小且不平衡，这些发现被视为初步结果。总体而言，该工作流程为表征苏格兰蜂蜜的季节变异和发现候选真实性标志物提供了稳健平台。

蜂蜜是化学组成复杂的天然食品，其组成受蜜源、地理、季节和采后处理共同影响。高端蜂蜜产品商业价值较高，因此该领域易受蜜源或地理来源错误标注、掺混以及外源糖稀释等真实性问题的威胁。此类问题要求分析方法不仅能区分真实的组成变异，还能以可辩护且化学可解释的方式识别异常轮廓。在此背景下，真实性检测需要超越总体组成测定，捕捉蜂蜜更广泛的小分子指纹。非靶向液相色谱–高分辨质谱（LC–HRMS）已成为食品真实性研究的重要平台，可对化学多样性化合物进行广泛代谢谱分析，并支持复杂食品基质的多变量分类。在蜂蜜中，非靶向LC–MS工作流已被用于按蜜源、地理来源和产品类型区分样品，其中酚酸、黄酮及相关植物化学物作为候选判别标志物尤其受关注。这些化合物主要来源于花蜜、花粉和植物相关代谢，因此反映可能随区域和季节变化的花源与环境输入。然而，现有工作流常依赖多步或相对溶剂密集的制备程序，且非靶向数据集中判别特征的注释仍是持续存在的限制。蜂蜜代谢组学的一个特殊挑战在于，许多候选标志物属于结构相关化学类别，并可能以异构体或密切相关物种存在；因此，仅基于精确质量和保留时间的归属仍不确定，尤其是在缺乏标准品时。离子迁移–质谱（IM–MS）基于离子大小、形状和电荷提供额外分离维度，并提供碰撞截面（CCS）值作为正交描述符，可增强代谢物注释置信度。尽管IM–MS在更广泛的代谢组学研究中受到关注，但其在蜂蜜真实性中的应用仍有限。对于蜂蜜这类化学复杂基质，异构现象可能使酚类特征解释复杂化，因此将离子迁移整合到非靶向LC–HRMS工作流中具有明显潜力，可提高结构置信度和真实性相关标志物的可解释性。苏格兰蜂蜜为评估此类方法提供了有用案例。其生产跨越不同生态环境和花蜜来源，包括以石楠为主的景观和混合季节性花环境，可能产生化学上可区分的轮廓。同时，苏格兰蜂蜜在市场中占据区域优质利基，因此可辩护的组成表征对生产者和真实性筛查均具相关性。然而，尽管先前关于苏格兰蜂蜜的工作强调了选定的理化、矿物质或生物活性相关性质，跨季节和市场相关产品类别的系统性非靶向化学谱分析仍有限。特别是，利用CCS支持的代谢组学证据能在多大程度上区分苏格兰蜂蜜与进口、混合或浸渍产品，尚未很好建立。

在本研究中，研究人员开发了低溶剂、以酚类为重点的非靶向UHPLC–IM–QTOF-MS工作流，并主要将其应用于季节性苏格兰蜂蜜的化学表征。该分析策略结合了简化样品制备、基于质量控制的信号过滤、MS/MS证据和CCS辅助注释。该工作旨在为复杂天然食品基质中的蜂蜜真实性评估和标志物发现建立化学可解释的筛查级平台。研究还纳入了有限且异质的非苏格兰、混合和浸渍商业产品，以探索工作流的更广泛适用性；这些样品并非旨在形成代表性地理类别或受控产地验证数据集。该研究发表于《Food Chemistry》。

为开展研究，研究人员使用的关键技术方法可概括为：样本队列为39个蜂蜜样品，包括苏格兰石楠蜜（n=5）、春季蜜（n=11）和夏季蜜（n=12），其中约9个来自Aberdeenshire的蜂场提供配对春、夏样品；非苏格兰比较组包括商业混合蜜（n=3）、中国标签蜜（n=1）、希腊、西班牙、意大利和捷克各1个，以及浸渍蜜（n=3），收获期为2024–2025年。样品经酸水稀释、乙腈提取，基于糖辅助液–液萃取（SULLE）原理，过滤、氮吹并复溶。分析采用UHPLC–IM–QTOF-MS负离子模式，MS1和AutoMSMS采集，离子迁移 multiplexing并计算CCS。以合并质量控制（QC）样品和稀释系列评估稳定性，采用基于QC的正则化样条校正（QCRSC）校正信号漂移，经MS-DIAL和Mass Profiler处理，结合精确质量、保留时间、MS/MS和CCS进行注释，并采用主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）、变量投影重要性（VIP）、方差分析（ANOVA）和错误发现率（FDR）进行统计分析。

研究结果如下。3.1 方法性能：通过QC样品评估，经过QC信号校正和过滤后，最终保留1738个特征用于下游统计；标准品绝对质量误差平均1.82 ppm，CCS偏差平均0.6%，保留时间稳定，QC在PCA空间中紧密聚集。研究人员认为最终特征矩阵具有分析稳定性，适合下游多变量分析，并支持CCS作为增强注释的正交参数。3.2 苏格兰蜂蜜与探索性市场比较样品的色谱定性变化：代表性总离子流图显示不同蜂蜜组轮廓复杂度存在可见差异；苏格兰蜂蜜，包括石楠蜜和季节性样品，通常在中后保留时间窗口显示更多解析特征，而超市混合和中国标签产品轮廓相对简单，欧洲蜂蜜表现中间且异质，浸渍蜂蜜出现与配方来源成分一致的额外信号。该定性观察表明工作流在多变量分析前即可捕获产地和产品类型相关的广泛组成差异。3.3 地理来源判别：对过滤后的UHPLC–IM-QTOF–MS特征矩阵进行探索性OPLS-DA，显示苏格兰与欧洲蜂蜜组之间清晰分离，模型指标为R²Y=0.99、Q²=0.69，置换检验和CV-ANOVA支持模型显著性。代表性判别特征包括p-coumaric acid、gallic acid、neochlorogenic acid、jasmonic acid、3-phenyllactic acid、isokaempferide以及与kaempferol coumaroyl-glucoside相关的特征。研究人员指出，由于欧洲比较组在蜜源和地理上均与苏格兰组不同，且多为单样本，这些示例标志物应被解读为工作流可检测市场蜂蜜间组成差异的证据，而非已验证的地理来源标志物。3.4 季节性判别：PCA显示苏格兰春季、夏季和石楠蜜存在结构化变异，探索性PLS-DA显示清晰类别相关分离，R²Y=0.81、Q²=0.70，p<0.001。蜂场内部配对春与夏比较的探索性OPLS-DA显示强类别分离，R²Y=0.95、Q²=0.77，p<0.05。石楠蜜中4-hydroxycinnamaldehyde、kaempferol共轭特征、3-phenyllactic acid和abscisic acid相对丰度较高，而春季与夏季蜂蜜在羟基肉桂酸酰胺，包括di-和tricoumaroyl spermidines，以及gluconic acid和sebacic acid等有机酸上差异更强。研究人员将这些差异解释为季节相关，并可能至少部分反映蜜蜂可利用花源的变化。3.5 商业蜂蜜产品中掺混和浸渍的特征：探索性PLS-DA按产品类型显示不同指纹，可区分超市混合蜜、浸渍产品和苏格兰参考蜂蜜，R²Y=0.94、Q²=0.56。混合/中国组中d-fructose、L-arabinose和N-fructosyl pyroglutamate等碳水化合物相关信号较高，常见酚类标志物isorhamnetin、naringenin和galangin相对较低。浸渍产品中，苹果–肉桂浸渍蜂蜜富集trans-cinnamic acid和chlorogenic acid，香料浸渍蜂蜜富集curcumin。苹果–肉桂浸渍蜂蜜在PC得分空间中位于春季与夏季Aberdeenshire蜂蜜之间，提示基础蜂蜜轮廓仍可检测。研究人员认为该方法可检测掺混和浸渍特征，并捕获基础蜂蜜性状和配方来源化合物。3.6 所选标志物的注释置信度和QC响应行为：1738个保留特征中51个获得推定注释，包括41个MSI Level 2、6个MSI Level 3和4个MSI Level 1。四个选定标志物3-phenyllactic acid、abscisic acid、tricoumaroyl spermidine和sebacic acid的MS/MS碎片模式与注释一致，CCS值提供正交支持；galangin、kaempferol、isorhamnetin和p-coumaric acid经同批次真实参考标准品确认。四个标志物在合并QC稀释系列中表现强线性，R²=0.93至0.996。研究人员认为该LC–IM–MS工作流不仅能判别蜂蜜类别，还能对代表性化学标志物进行可靠注释和稳健追踪。

讨论部分总结认为，该研究建立了以酚类为重点的非靶向UHPLC–IM–QTOF-MS工作流，将低溶剂样品制备、QC控制的仪器性能和CCS辅助注释结合，用于筛查级蜂蜜真实性评估。其价值不仅在于类别分离，还在于将这些分离与异质、市场相关蜂蜜产品中分析稳定且化学可解释的特征联系起来。将离子迁移整合到非靶向酚类真实性工作流是核心优势；CCS提供与m/z和色谱保留正交的分子描述符，提高判别标志物注释置信度。光谱方法可提供快速全局指纹，而LC–MS提供化合物分辨和结构证据。该工作通过合并QC监测、QC稀释响应和QCRSC减少运行顺序效应和不稳定特征影响。配对季节性设计减少位置和生产者混杂，支持将季节性纳入真实性模型。石楠蜜在数据集中呈现化学独特类别，其标志物包括3-phenyllactic acid、abscisic acid、4-hydroxycinnamaldehyde和kaempferol共轭特征。商业混合和浸渍产品可掩盖与产地相关的化学特征，研究中观察到混合产品碳水化合物相关特征更突出而常见酚类强度较低，这与掺混、加工和/或花源特征稀释导致的组成简化一致，但不能单独证明外源糖浆掺假。浸渍产品还含配方来源植物化学物，苹果–肉桂浸渍蜂蜜与Aberdeenshire春季/夏季蜂蜜更接近，提示指纹可保留基础蜂蜜和添加成分信息。局限性包括：非苏格兰蜂蜜和特定浸渍风味样本量有限，部分组n=1；多数苏格兰蜂蜜来自Aberdeenshire；未对外源糖浆掺假进行确证；未使用内标进行提取回收和全过程重复性评估；CCS参考数据有限限制注释深度。尽管如此，该工作流溶剂使用低于2 mL，具有低溶剂和简化制备优势，并且据研究人员所知，是首次对苏格兰蜂蜜进行以酚类为重点的非靶向代谢组学表征。

研究结论翻译：本研究证明，以酚类化合物为重点的非靶向UHPLC–IM–QTOF-MS，结合低溶剂提取工作流、基于QC的信号校正和CCS辅助注释，为蜂蜜代谢组学分析提供了稳健且化学信息丰富的平台。最强发现是苏格兰蜂蜜内部的季节相关差异，包括来自同一蜂场的配对春–夏样品以及石楠蜜的独特轮廓。还观察到苏格兰与非苏格兰样品之间以及混合与浸渍产品之间的探索性差异；然而，由于若干组较小且不平衡，这些发现应被视为产生假设而非地理来源或产品真实性的验证证据。离子迁移、MS/MS和CCS的整合加强了对候选判别特征的解释，但在该工作流能够支持可转移的蜂蜜可追溯性应用之前，仍需更广泛采样、真实标准品确认和独立验证。