《Food Chemistry: X》：Screening and identification of a novel umami peptide with
in vitro anti-inflammatory potential from sea cucumber protein: Integration of flavoromics, bioinformatic prediction, molecular simulation and experimental validation
编辑推荐：
海参是中国传统的高价值海产品，其年养殖产量已超过22万吨，为深加工利用提供了丰富的蛋白质资源。本研究以海参蛋白为原料，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和肠激酶的顺序酶解工艺制备海参肽，综合利用扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、紫外-可见光谱（UV
海参是中国传统的高价值海产品，其年养殖产量已超过22万吨，为深加工利用提供了丰富的蛋白质资源。本研究以海参蛋白为原料，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和肠激酶的顺序酶解工艺制备海参肽，综合利用扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、紫外-可见光谱（UV–Vis）、内源荧光光谱、X射线衍射（XRD）和差示扫描量热法（DSC）表征酶解前后蛋白质微观形态、分子构象、聚集状态和热稳定性的差异；采用顶空固相微萃取-气相色谱-静电场轨道阱质谱（HS-SPME-GC-Orbitrap/MS）结合多元统计方法进行风味组学分析；通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）精确鉴定肽序列，并应用生物信息学工具从味觉特性、免疫调节活性和安全性等多维度筛选候选肽，利用电子舌验证味觉特性；通过分子对接和分子动力学模拟初步探究特征肽与免疫靶点的相互作用机制，并采用RAW 264.7巨噬细胞模型验证免疫调节活性。研究结果显示，顺序酶解有效破坏了海参蛋白的致密三维网络，诱导构象展开，增加无序二级结构比例，暴露疏水核心中包埋的芳香族氨基酸残基；酶解产物以0.5–1.5 kDa的短肽为主，亲水性增强，加工适应性改善。酶解显著重塑了挥发性风味谱，促进脂质氧化和美拉德反应，导致醛类和杂环化合物显著富集。通过多维生物信息学筛选结合电子舌验证，鉴定出五肽FDRGF为核心候选肽，其具有优异的鲜味特性、低苦味和良好的免疫调节潜力。分子对接和100 ns分子动力学模拟证实FDRGF能与关键炎症靶点（TNF、AKT1和IL-1β）形成稳定复合物，其中与AKT1的结合亲和力最强。体外细胞实验进一步验证，FDRGF在测试浓度范围内无细胞毒性，可通过降低细胞内活性氧（ROS）水平、抑制NF-κB活化以及下调IL-1β、TNF-α、IL-6和COX-2等促炎介质的表达，有效缓解脂多糖（LPS）诱导的炎症损伤。综上所述，本研究阐明了多酶水解条件下海参蛋白的结构-风味-活性关联，鉴定出一种兼具优异鲜味和体外抗炎潜力的特征肽，为海参资源的高值化深加工和风味功能性肽的开发提供了理论依据和实验证据。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
海参是中国传统的高价值海产品，年养殖产量已超过22万吨，为深加工利用提供了丰富的蛋白质原料资源。海参富含优质胶原蛋白、多糖及多种生物活性成分，兼具食用和药用价值。随着海洋食品产业向深加工方向转型，传统的水发、干燥等初级加工方式已无法满足高值化利用的需求，如何通过现代生物技术充分释放海参蛋白的营养和功能价值，开发高附加值食品配料，已成为海参加工领域的研究热点。
生物活性肽是通过酶解或分离纯化从蛋白质中衍生出的小分子肽，具有分子量低、易消化吸收、生理活性温和、安全性高等特点，在功能食品、营养补充剂和特殊膳食产品中具有广阔应用前景。其中，免疫调节活性是食品源肽最受关注的核心功能之一。与药物干预不同，食品源免疫调节肽主要通过调节固有免疫细胞的生理状态、维持免疫稳态、增强机体对外界刺激的防御能力来发挥营养调控作用。已有研究证实多种海洋源蛋白肽具有免疫调节潜力，但海参源肽的研究多集中于粗提物的活性验证，对特征肽的精确鉴定、构效关系和分子机制的系统分析仍相对不足。
风味质量是决定食品配料市场接受度和应用场景的核心感官属性，也是肽产品开发中不可忽视的关键因素。酶解蛋白是制备活性肽的核心技术，在酶解过程中，蛋白酶在切割肽键释放活性肽片段的同时，也会破坏原料的基质结构，促进脂质氧化和美拉德反应等一系列化学反应，从而从挥发性香气和滋味两个维度重塑产品的风味特征。适度酶解可释放呈味氨基酸和鲜味肽，改善产品风味复杂度；而酶解不足或过度则可能引入苦味和腥味等感官缺陷。近年来，基于GC-Orbitrap/MS和电子舌味觉分析的高分辨率风味组学技术快速发展，为系统识别酶解过程中的风味缺陷和有益呈味化合物、精准靶向特征呈味肽提供了有力工具。然而，目前海参肽研究多将风味作为附属指标仅作简要描述，鲜有从蛋白质结构演化视角阐明酶解对风味形成的调控机制，同时兼顾味觉特性和免疫调节活性的定向肽筛选更为罕见，这制约了海参肽作为高品质风味功能配料的应用。
在此背景下，本研究以海参蛋白为原料，采用胃蛋白酶-胰蛋白酶-肠激酶顺序酶解工艺制备海参肽，旨在阐明特定多酶水解条件下蛋白质结构改变、挥发性风味重塑与肽源生物活性之间的内在关联，并鉴定兼具优异鲜味和免疫调节活性的海参源特征肽，为海参资源的高值化深加工和风味功能性肽的开发提供理论依据。
二、研究设计与技术路线
研究人员采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和肠激酶的顺序酶解工艺处理海参蛋白，酶与底物质量比为1%，胃蛋白酶水解在pH 2.0条件下进行，胰蛋白酶和肠激酶水解在pH 8.0条件下进行，各阶段均在37°C反应4小时，并以不添加外源蛋白酶的空腹对照消除原料内源蛋白酶干扰。酶解产物的水解度采用邻苯二甲醛（OPA）比色法测定。结构表征方面，综合运用扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、紫外-可见光谱（UV–Vis）、内源荧光光谱、X射线衍射（XRD）和差示扫描量热法（DSC）六种技术手段。风味分析采用顶空固相微萃取-气相色谱-静电场轨道阱质谱（HS-SPME-GC-Orbitrap/MS）结合主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）等多元统计方法。肽序列鉴定采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），数据库检索针对海参（Holothuroidea）蛋白数据库。生物信息学筛选综合运用多个在线工具，包括鲜味预测、苦味预测、生物活性评分（PeptideRanker）、免疫调节潜力评估（CSM-peptides）、水溶性预测、毒性预测（ToxinPred）和致敏性评估（AllerTOP v2.1）。分子对接和100 ns分子动力学模拟采用GROMACS 2020.6进行。味觉验证采用ASTREE II电子舌系统。免疫活性验证采用RAW 264.7巨噬细胞模型，结合MTS法、H&E染色、Hoechst 33342染色、DCFH-DA荧光探针、双荧光素酶报告基因和Western blot等检测手段。
三、研究结果
3.1 水解度测定。 顺序酶解后海参蛋白的水解度（DH）达到40.72±1.19%，表明该多酶组合有效切割了大分子胶原蛋白的肽键，产生了大量肽片段，为后续结构变化、风味重塑和生物肽鉴定提供了基础证据。
3.2 微观形态观察。 扫描电子显微镜（SEM）显示，未酶解的海参蛋白呈不规则片状和块状聚集体，边缘尖锐、结构致密、表面相对光滑；酶解后的海参肽呈现明显的多孔结构，形成网络状或海绵状结构，孔壁较厚且孔道相互连通。这种多孔粗糙的表面形态主要归因于蛋白酶切割大分子肽键，破坏了原有的致密空间结构，同时水解过程中小分子释放和气体逸出促进了新通道的形成。
3.3 FTIR分析。 傅里叶变换红外光谱（FTIR）显示，酶解后酰胺I带（1600–1700 cm?1）出现明显的峰分裂和位移，α-螺旋等有序结构比例降低，无规则卷曲等无序结构比例增加；酰胺II带（约1540 cm?1）吸收强度显著增强，反映单位质量肽键总数增加。其机制在于α-螺旋构象高度依赖链内和链间氢键网络，肽键切割破坏了原有的氢键平衡，导致有序螺旋去聚合转化为无规则卷曲构象。
3.4 UV–Vis吸收光谱分析。 酶解后220 nm处肽键吸收峰显著增强，280 nm处芳香族氨基酸吸收峰出现增色效应，表明酶解诱导多肽链展开，使原本包埋在疏水核心中的芳香族氨基酸残基暴露于极性环境，增加了多肽链的亲水性，为后续溶解度改善提供了化学基础。
3.5 内源荧光光谱分析。 酶解后荧光强度显著增加，发射峰发生红移，最大发射波长从约330 nm移至约345 nm。发射峰红移是色氨酸（Trp）残基周围环境极性增加的可信指标，证实酶解破坏了三级结构并诱导多肽展开，将Trp残基从疏水核心暴露至水相环境，提高了肽的溶解性和分子柔性。
3.6 XRD分析。 X射线衍射（XRD）显示蛋白和肽组在2θ≈20°处均呈现宽弥散峰，均属无定形结构；但肽组衍射峰强度显著更高、峰形更尖锐，表明酶解后短肽分子在干燥过程中可能通过分子间氢键重排形成更高程度的短程有序排列，这也解释了其良好的成粉性能。
3.7 DSC分析。 差示扫描量热法（DSC）显示，蛋白组在约100°C附近出现明显的蛋白质变性吸热峰；肽组吸热峰强度显著降低、峰形变宽，变性温度（Tm）降低甚至消失。这表明酶解将大分子蛋白降解为小分子肽，破坏了维持热稳定性的完整三级结构，焓变（ΔH）显著降低，小分子肽段不再表现出完整蛋白质特有的协同热变性行为，加工适应性良好。
3.8 风味组学分析。 主成分分析（PCA）显示蛋白组和肽组在PC空间中完全分离，表明酶解诱导了风味谱的根本性转变。与蛋白组相比，肽组的醛类、醇类和杂环化合物相对丰度或数量显著增加，醛类成为肽组的主要风味贡献物。感官属性雷达图显示，肽组在"脂肪味""青草味""油炸味"和"蜡味"等维度响应强度显著增强，而蛋白组以"泥土味"和"清新味"为主。差异分析鉴定出147种显著差异代谢物（VIP>1，P<0.05），其中74种在肽组中显著上调，主要包括己醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛等不饱和脂肪酸氧化产物，以及2-戊基呋喃和三甲基吡嗪等热反应风味化合物。相关性分析显示，己醛和(E,E)-2,4-壬二烯醛是"青草味"和"脂肪味"的主要驱动因子，三甲基吡嗪和2-戊基呋喃与"油炸味"和"蜡味"高度相关。酶解破坏了致密的三维蛋白网络，使脂质更易暴露于氧气而发生酶促或自动氧化，生成大量C6-C9醛类；同时酶解产生的丰富游离氨基和小分子肽作为反应物，在加热干燥过程中与还原糖发生美拉德反应，生成具有"烘烤味""油炸味"和"坚果味"的挥发性化合物。
3.9 肽序列鉴定。 液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析显示，鉴定到的肽段长度主要分布在5–15个氨基酸之间，呈右偏分布，峰值位于9–10个氨基酸，平均链长约9.5个氨基酸；分子量主要集中在0.5–1.5 kDa，峰值约1.0 kDa；鉴定置信度分数（-10lgP）主要集中在15–25之间，统计可靠性高。氨基酸组成分析显示，甘氨酸（Gly）和谷氨酰胺/谷氨酸（Gln/Glu）是最丰富的残基（平均丰度均超过13%），甘氨酸作为胶原蛋白标志物占比极高，证实酶解产物主要来源于海参胶原蛋白。等电点（pI）与平均亲水性（GRAVY）相关性分析显示，多数肽的pI集中在6.0–7.5之间，GRAVY值大多低于0，表明这些肽整体呈弱酸性至中性且亲水。高置信度肽主要集中在5–12个氨基酸且GRAVY为负值的区域，表明短链亲水性胶原肽是酶解产物中的主要活性形式。
3.10 生物信息学分析。 基因本体论（GO）富集分析显示，生物学过程主要富集于"一氧化氮生物合成过程的正调控""化学应激的细胞响应"和"有机氮化合物响应"。基因集分析显示这些通路主要涉及ERBB2、LYN、CXCR4、ITGB1和IL1B等关键功能基因。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示，海参肽潜在靶点显著集中于"内分泌抵抗""前列腺癌""EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药"和"糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路"。通路-基因映射图揭示IL1B、TNF、AKT1、STAT3、EGFR和MAPK1是连接上述疾病通路的核心枢纽基因。疾病富集分析显示海参肽靶点与多种炎症性疾病（如结肠炎和牙周炎）、代谢综合征（动脉粥样硬化）和恶性肿瘤（乳腺癌和胰腺癌）密切相关。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络以IL1B、TNF、AKT1、STAT3、EGFR和MAPK1为核心节点，提示海参肽可能通过多靶点多通路机制发挥协同免疫调节或代谢干预作用。
3.11 肽筛选。 基于LC-MS/MS鉴定和生物信息学预测，共获得16条高置信度海参源肽。以"鲜味概率≥0.23、生物活性评分≥0.97、无毒、无苦味"为初筛阈值，FDRGF、CPPGFMG和FFSLFCLL被选为核心候选肽。其中FDRGF具有最高的鲜味概率（0.557）和优异的抗炎活性评分（0.78），且无致敏性；CPPGFMG鲜味概率中等（0.249）但生物活性评分最高（0.981）；FFSLFCLL兼具高生物活性（0.979）和中等鲜味潜力。其余肽因鲜味概率低、苦味预测、水溶性差或致敏风险而被排除。
3.12 电子舌分析。 主成分分析（PCA）显示三种候选肽与空白对照（水）和阳性对照（谷氨酸钠MSG、谷胱甘肽GSH）显著分离，组内重复样本紧密聚集。雷达图和柱状图定量显示：FDRGF呈现极高的鲜味响应（78），仅次于MSG（85），且苦味和涩味响应极低，具有类似MSG的纯净鲜味特征；CPPGFMG鲜味响应中等（48），但具有显著的余味和浓厚感（kokumi）特征，风味轮廓类似GSH；FFSLFCLL虽具有一定鲜味，但伴随显著的苦味和涩味响应，整体味觉品质较差。电子舌验证结果与生物信息学预测高度一致，确认FDRGF为理想的"鲜味-免疫调节"双功能核心候选肽。
3.13 分子对接与分子动力学模拟。 基于靶点筛选结果，选择与炎症相关的TNF、AKT1和IL-1β作为分子对接靶点。肽TH（FDRGF）与三个靶点的结合能分别为?5.3 kcal/mol、?9.9 kcal/mol和?5.6 kcal/mol，其中与AKT1的结合亲和力最强。100 ns分子动力学模拟中，三个蛋白-配体复合物的均方根偏差（RMSD）曲线均收敛至1–3 ?稳定范围，表明系统达到平衡，TH能与三个靶蛋白形成稳定复合构象。均方根波动（RMSF）分析显示，与TH接触的残基RMSF值显著较低，表明配体结合限制了这些区域的柔性，而远离结合位点的区域波动较高，这种结合模式既保证了相互作用特异性，又维持了蛋白质必要的构象可塑性。
3.14 免疫调节活性验证。 MTS法检测显示，不同浓度TH（6.25–100 μg/mL）处理组细胞活力均保持在95.28%以上，与空白对照组无显著差异（P>0.05），表明TH在测试浓度范围内无细胞毒性。在脂多糖（LPS）诱导的炎症模型中，LPS刺激将巨噬细胞活力显著降低至约84.13%（P<0.01），TH预处理（12.5–50 μg/mL）剂量依赖性地改善细胞代谢活性，50 μg/mL时达到峰值（P<0.01）。H&E染色显示LPS处理组细胞出现典型的收缩、变圆和脱落，TH处理组（尤其25和50 μg/mL）细胞形态显著改善，恢复典型的巨噬细胞样铺展形态并可见伪足。Hoechst荧光染色显示TH处理有缓解LPS诱导的核固缩和异常核形态的趋势。活性氧（ROS）水平检测显示，LPS刺激显著增加细胞内ROS水平（P<0.01），TH处理剂量依赖性地降低ROS水平（P<0.05或P<0.01）。双荧光素酶报告基因实验证实TH能剂量依赖性地显著抑制LPS诱导的NF-κB转录活性。Western blot分析显示，LPS刺激显著上调IL-1β、TNF-α、IL-6和COX-2的蛋白表达，TH预处理剂量依赖性地下调这些免疫效应分子的表达。上述结果表明，TH可通过调节ROS和转录因子NF-κB维持巨噬细胞稳态并调节免疫应答强度。
四、讨论与结论
本研究的讨论部分指出，该研究仅基于LPS诱导的巨噬细胞炎症损伤体外模型，该模型主要反映炎症应激条件下的抗炎性能，不能完全代表涵盖固有-适应性免疫调节、免疫细胞分化或体内免疫稳态的综合免疫调节效应；MTS法仅监测细胞代谢活性，不能等同于巨噬细胞免疫功能的完全恢复，后续需多种免疫细胞模型和动物体内实验以全面评估TH的免疫调节效能。
研究结论部分指出，本研究系统探究了海参蛋白在顺序酶解过程中的结构演化、风味重塑和生物活性。结果表明，胃蛋白酶-胰蛋白酶-肠激酶水解有效破坏海参蛋白的致密三维网络，诱导构象展开，增加无序二级结构比例，暴露疏水核心中包埋的芳香族氨基酸残基；酶解产物以短肽（0.5–1.5 kDa）为主，亲水性增强，加工适应性改善。酶解通过促进脂质氧化和美拉德反应显著重塑挥发性风味谱，醛类和杂环化合物显著富集，赋予产品更复杂的风味层次。通过多维生物信息学筛选结合电子舌验证，鉴定出TH（FDRGF）为核心候选肽，兼具优异鲜味、低苦味和良好免疫调节潜力。分子对接和100 ns分子动力学模拟证实TH能与关键炎症靶点（TNF、AKT1和IL-1β）形成稳定复合物，其中与AKT1亲和力最强。体外细胞实验进一步验证TH在测试浓度范围内无细胞毒性，可通过降低细胞内ROS水平、抑制NF-κB活化以及下调IL-1β、TNF-α、IL-6和COX-2等促炎介质表达，有效缓解LPS诱导的炎症损伤。本研究阐明了多酶水解条件下海参蛋白的结构-风味-活性关联，鉴定出一种兼具鲜味和体外抗炎潜力的特征肽，为海参深加工和风味功能性肽开发提供了理论依据和实验证据。
