《Food Chemistry: X》：Bromelain-induced physicochemical and structural changes in beef myofibrillar proteins and their molecular interaction mechanisms
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肌原纤维蛋白（myofibrillar proteins, MP）是肉类中最主要的结构蛋白组分，约占肉类总蛋白的55%–65%，主要由肌球蛋白和肌动蛋白组成，对维持肌肉组织完整性及决定肉制品的关键品质属性（包括蛋白质溶解度、凝胶行为、持水性和风味形成）起着至关
肌原纤维蛋白（myofibrillar proteins, MP）是肉类中最主要的结构蛋白组分，约占肉类总蛋白的55%–65%，主要由肌球蛋白和肌动蛋白组成，对维持肌肉组织完整性及决定肉制品的关键品质属性（包括蛋白质溶解度、凝胶行为、持水性和风味形成）起着至关重要的作用。因此，阐明MP结构变化的模式及其调控机制对于提升肉制品品质具有重要意义。菠萝蛋白酶是一种植物源性蛋白酶，已被广泛研究用于肉类嫩化。尽管已有研究报道了菠萝蛋白酶水解对MP结构和功能特性的影响，但菠萝蛋白酶与MP代表性主要组分之间的分子相互作用以及由此产生的动态构象响应仍未得到充分理解。因此，本研究以牛背最长肌提取的MP为实验体系，系统研究了不同浓度菠萝蛋白酶对其理化性质、聚集行为和多层次结构特征的影响。进一步采用分子对接和分子动力学模拟（molecular dynamics simulations, MDS）技术，研究了菠萝蛋白酶与代表性肌球蛋白重链（myosin heavy-chain, MHC）模型之间的潜在相互作用及相关构象响应。这种整合实验与计算的研究方法旨在提供菠萝蛋白酶诱导MP结构修饰的更详细分子层面的理解，并为其在肉品品质调控中的合理应用提供支持。
论文解读文章
一、研究背景与目的
肉类加工过程中，肌原纤维蛋白（myofibrillar proteins, MP）作为构成肌肉纤维的主要结构蛋白框架，其结构和功能的稳定性直接影响肉制品的品质，如蛋白质溶解度、凝胶特性、持水性和风味形成。菠萝蛋白酶作为一种植物源性蛋白酶，已被广泛应用于肉类嫩化，其作用机制通常归因于对MP和结缔组织蛋白的水解。然而，现有研究大多集中在表征蛋白水解模式、整体结构变化和宏观嫩化效果上，对于菠萝蛋白酶与MP代表性主要组分（尤其是肌球蛋白重链（myosin heavy-chain, MHC））之间的分子相互作用，以及由这些相互作用引发的动态构象响应，仍缺乏深入理解。为此，研究人员开展本研究，旨在通过系统的实验和计算方法，揭示菠萝蛋白酶浓度依赖性地改变MP理化性质、聚集行为和多层次结构特征的规律，并从分子层面阐明其相互作用机制，为菠萝蛋白酶在肉品品质调控中的理性应用提供理论依据。
二、主要关键技术方法
- 1.
MP提取与处理：从牛背最长肌中提取MP，设置对照组及0.10%、0.25%、0.50%、0.75%（w/w，菠萝蛋白酶/MP）四个酶处理组，在40°C下孵育30分钟进行反应。
- 2.
理化性质测定：通过双缩脲法测定溶解度；使用紫外-可见分光光度计在600 nm处测定浊度；利用粒度分析仪测定平均粒径和多分散性指数（polydispersity index, PDI）。
- 3.
结构与相互作用分析：采用不同提取介质评估离子相互作用、氢键、疏水相互作用和二硫键等分子间作用力；使用Ellman试剂测定总巯基含量；通过溴酚蓝（bromophenol blue, BPB）结合法测定表面疏水性；利用紫外吸收光谱、内源荧光光谱和傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR）分析结构特征；采用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）观察微观形态；通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）分析蛋白降解情况。
- 4.
计算模拟：基于同源建模构建牛MHC的三维模型，与菠萝蛋白酶晶体结构进行刚性分子对接；使用GROMACS软件进行100 ns的分子动力学模拟（molecular dynamics simulations, MDS），分析复合物的均方根偏差（root-mean-square deviation, RMSD）、均方根波动（root-mean-square fluctuation, RMSF）、氢键数量、回转半径（radius of gyration, Rg）和溶剂可及表面积（solvent-accessible surface area, SASA）。
三、研究结果
3.1 溶解度和浊度
通过测定发现，随着菠萝蛋白酶添加量从0.10%增至0.50%，MP溶解度逐渐升高并在0.50%时达到最大值81.53%，而继续增至0.75%时溶解度下降。这表明适量酶解促进MP解聚，暴露极性和带电基团，增强水合作用；过量酶解则导致小分子肽和疏水基团重新聚集形成不溶性聚集体。浊度测定结果显示，所有菠萝蛋白酶处理组的浊度均显著低于对照组，其中0.50%组最低，表明适度酶解促进了MP聚集体的解离，提高了体系的分散稳定性。
3.2 平均粒径和PDI
粒度分析结果表明，菠萝蛋白酶处理显著降低了MP的平均粒径，0.50%组达到最小值。PDI值从对照组的0.871逐步降至0.50%组的0.338，随后在0.75%组略有回升至0.437。这说明适度酶解有效破坏了蛋白质聚集体，使粒径分布更集中、均匀，改善了体系的分散特性。
3.3 分子间作用力
通过不同提取介质分析分子间作用力发现，与对照组相比，经菠萝蛋白酶处理后，所有处理组的离子相互作用和氢键作用均降低，在0.50%组达到最低水平；疏水相互作用则随酶浓度增加而增强，同样在0.50%组最高；二硫键的相对贡献也较对照组有所降低。这表明显适度的酶解破坏了原有的有序氢键网络和静电相互作用，促使MP构象变得松散，同时促进了内部疏水残基向外迁移。
3.4 总巯基含量
总巯基含量测定显示，0.10%–0.50%处理组的总巯基含量显著高于对照组，0.50%组达到较高水平；而0.75%组则略有下降。这表明适度酶解促进了MP构象变化，增加了游离巯基的可及性；过度酶解则可能因疏水片段聚集或巯基-二硫键重排导致巯基被重新掩埋。
3.5 结构特性分析
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3.5.1 表面疏水性：BPB结合实验表明，菠萝蛋白酶处理显著提高了MP的表面疏水性，并随酶浓度增加而增大，在0.50%时达到峰值，随后在0.75%时略微下降。这与溶解度变化趋势一致，说明适度酶解破坏了非共价相互作用，暴露了更多疏水基团；过度酶解则引发重新聚集，部分疏水基团再次被包埋。
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3.5.2 紫外吸收光谱：紫外光谱显示，菠萝蛋白酶处理增强了MP在233 nm和275–282 nm附近的吸收强度，且在0.50%组最强，0.75%组反而减弱。这反映了酶解使蛋白结构展开，暴露了芳香族氨基酸残基；过度酶解导致的二次聚集使部分发色团重新被掩埋。
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3.5.3 内源荧光光谱：荧光光谱分析表明，菠萝蛋白酶处理提高了MP的内源荧光强度，0.50%组最高，并伴随最大发射峰轻微红移。这表明适度酶解诱导蛋白部分展开，增加了色氨酸残基的极性环境暴露；0.75%时荧光强度下降，提示过度水解导致疏水基团重新包埋。
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3.5.4 FT-IR：FT-IR分析显示，随着菠萝蛋白酶浓度增加，酰胺A带从3304 cm-1逐渐蓝移至3405 cm-1，表明氢键相互作用被破坏。对酰胺I带去卷积和二阶导数分析发现，α-螺旋和β-折叠含量下降，β-转角和无规卷曲含量上升，有序二级结构相对含量从70.97%降至50.37%，无序结构从29.03%增至49.63%。这说明酶解导致了MP从有序致密向松散无序的构象重组。
3.6 SEM
SEM观察显示，未经处理的MP呈紧密堆积的大块状聚集体。经0.10%菠萝蛋白酶处理后，聚集体开始碎裂，表面出现纹理和裂纹。随着酶浓度增至0.25%和0.50%，聚集体进一步解体，粒径显著减小，0.50%组呈现最分散、均匀分布的结构。而在0.75%组观察到部分重新聚集现象。这表明适度酶解有效破坏了MP的原始致密聚集结构，而过度酶解则可能导致小分子片段重新相互作用形成新的聚集体。
四、讨论与结论
讨论总结：
本研究的实验结果一致表明，菠萝蛋白酶对MP的改性作用呈现明显的浓度依赖性。在较低添加量（0.10%–0.50%）范围内，菠萝蛋白酶通过有限水解，优先作用于维持MP聚集结构的非共价相互作用（特别是氢键和离子相互作用），促使肌原纤维束解聚，蛋白构象展开，从而暴露出更多的极性基团、疏水残基和游离巯基。这一系列变化导致MP的溶解度提高、浊度和粒径降低、分散性改善，同时伴随着表面疏水性和总巯基含量的增加，以及紫外吸收和荧光强度的增强。FT-IR分析证实了有序二级结构（α-螺旋和β-折叠）向无序结构（β-转角和无规卷曲）的转变，而酰胺A带的蓝移进一步印证了氢键网络的破坏。SEM图像直观展示了聚集体从紧密块状到细小分散颗粒的演变过程。然而，当酶添加量升至0.75%时，过度水解产生了大量小分子肽和暴露的疏水基团，它们通过疏水相互作用重新聚集，导致溶解度、表面疏水性和荧光强度等指标下降，粒径和PDI略有回升，SEM也观察到部分重新聚集现象。分子对接和MDS结果从原子层面揭示了菠萝蛋白酶与MHC之间的相互作用模式，主要通过氢键和疏水相互作用稳定结合，诱导MHC发生构象变化，表现为RMSD和RMSF的增加、Rg的减小以及SASA的变化，这些计算结果与实验观察到的结构变化趋势相吻合。
研究结论翻译：
综上所述，本研究系统地阐明了菠萝蛋白酶浓度依赖性地调节牛肉MP理化性质和结构特征的规律。研究发现，0.50%（w/w）的菠萝蛋白酶添加量在提高MP溶解度和降低PDI方面表现最佳。分子间作用力分析表明，MP与菠萝蛋白酶主要通过氢键相互作用发生作用。分子动力学模拟进一步证实，菠萝蛋白酶诱导了肉蛋白的构象变化。这些发现为从分子层面理解菠萝蛋白酶介导的MP结构修饰提供了新的见解，并为菠萝蛋白酶在肉品品质调控中的精准应用奠定了理论基础。
