《Environment International》：Single-nucleus transcriptomics reveals chronic GenX exposure-induced neurotoxicity and predicted alterations in microglia-neuron communication networks in mouse brain
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GenX（hexafluoropropylene oxide dimer acid，HFPO-DA）作为传统长链全氟和多氟烷基物质（per- and polyfluoroalkyl substances，PFAS）的新兴替代物，其慢性暴露的神经毒性与机制仍不清
GenX（hexafluoropropylene oxide dimer acid，HFPO-DA）作为传统长链全氟和多氟烷基物质（per- and polyfluoroalkyl substances，PFAS）的新兴替代物，其慢性暴露的神经毒性与机制仍不清楚。研究人员建立慢性灌胃小鼠模型，联合靶向UPLC-MS/MS、分子生物学验证与单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq）系统研究发现，GenX暴露引起小鼠显著运动与记忆缺陷；靶向UPLC-MS/MS显示GenX在血液、肝脏与脑组织蓄积；Evans blue外渗增加及紧密连接蛋白下降表明肠道屏障与血脑屏障（blood–brain barrier，BBB）受损；snRNA-seq显示多类脑细胞广泛转录改变，神经元富集神经退行与凋亡相关通路，凋亡相关蛋白异常；小胶质细胞表现为活化基因上调、NLRP3/Caspase-1信号激活，拟时序中P2ry12降低、Apoe升高；CellChat预测NRXN、NCAM、Cx3cl1-Cx3cr1、Gas6-Mertk等小胶质细胞-神经元通讯改变。上述结果说明慢性GenX暴露通过屏障功能障碍、神经元凋亡、小胶质细胞炎症活化及细胞间通讯紊乱诱导广谱神经毒性。
研究背景方面，全氟和多氟烷基物质（per- and polyfluoroalkyl substances，PFAS）因环境持久性、生物蓄积性与难降解性成为重大公共健康隐患。GenX（hexafluoropropylene oxide dimer acid，HFPO-DA）被引入作为传统长链PFAS如全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）的替代品，虽最初被认为更安全，但已有研究提示其具有肝毒、免疫毒、发育毒与代谢扰动等效应。相较外周毒性，慢性GenX暴露对中枢神经系统的影响与机制研究不足；PFAS可否穿透血脑屏障（blood–brain barrier，BBB）虽有线索，但GenX在脑内定量的直接证据有限；传统转录组难以解析脑内细胞异质性；小胶质细胞与神经元如何协同参与GenX神经毒性尚不清楚。因此，研究人员在《Environment International》发表该项研究，用慢性经口暴露小鼠模型系统揭示GenX神经毒性机制。
主要关键技术方法方面，研究人员使用8周龄雄性C57BL/6J小鼠，设对照组与GenX 2 mg/kg/天灌胃3个月组；采用靶向UPLC-MS/MS定量血清、肝脏、全脑中GenX；以Evans blue外渗与紧密连接蛋白Western blot评估BBB及肠屏障；取脑进行单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq），经Cell Ranger、Seurat与Harmony整合，Leiden聚类注释为兴奋性神经元、抑制性神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质前体细胞和内皮细胞；组内用Wilcoxon检验找差异基因并做GO/KEGG富集；用Monocle2做小胶质细胞拟时序；用CellChat推断细胞间配体-受体通讯；行为学包括新物体识别、Barnes迷宫、开场、爬杆、平衡木、转棒与抓绳测试。
研究结果方面，3.1 GenX暴露诱导小鼠认知障碍与行为异常：通过新物体识别、Barnes迷宫、开场及运动协调测试，研究人员发现GenX组识别记忆、空间学习记忆下降，探索活动减少，爬杆与平衡木耗时增加，转棒落下的潜伏期缩短，抓绳评分降低，证明慢性GenX暴露致认知与运动行为损伤。
3.2 慢性GenX暴露促进组织蓄积并破坏肠屏障与BBB：UPLC-MS/MS证实GenX在血、肝、脑显著蓄积；Evans blue外渗增多，脑内Occludin、ZO-1、Claudin-5及肠内Occludin、ZO-1、Claudin1蛋白下降，说明GenX长期经口暴露同时破坏肠屏障与BBB并伴全身与脑内蓄积。
3.3 单核RNA测序揭示细胞异质性与细胞类型特异性转录改变：质控后65,262个核纳入分析，无监督聚类分7类主群；GenX组小胶质细胞比例升高、星形胶质细胞比例下降；兴奋性神经元与星形胶质细胞差异基因较多，多细胞类型呈现广泛转录重编程。
3.4 GenX暴露诱导神经元功能障碍与凋亡：神经元差异基因富集阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病及神经退行相关KEGG通路，GO涉及认知、学习记忆、突触功能；AUCell显示凋亡信号活性增强；Nissl染色见皮质与海马神经元形态与密度改变，Western blot示Bax/Bcl-2比与cleaved Caspase-3升高，NeuN阳性神经元Bcl-2荧光减弱，验证神经元损伤与凋亡。
3.5 GenX暴露活化小胶质细胞并促进神经炎症：小胶质细胞269个基因上调、133个下调；Aif1（Iba1）、Tyrobp、Cd68、Fcgr2b、Itgb2等活化/免疫基因上调；GO/KEGG富集翻译、氧化磷酸化、MAPK、PI3K-Akt、cAMP与NOD-like receptor信号；GSEA示NOD-like receptor信号激活、TGF-β信号受抑；蛋白水平Iba1、NLRP3、cleaved Caspase-1、成熟IL-1β、TNF-α升高，IL-10与TGF-β降低，表明小胶质细胞向促炎态转变。
3.6 拟时序分析揭示GenX相关小胶质细胞转录状态改变：Monocle2将小胶质细胞排为3种状态，对照组密度峰在早拟时序，GenX组分布更广且峰靠后；稳态标记P2ry12沿轨迹下降，Apoe在后段明显上升；早期基因簇涉趋化、黏附、神经发育，后期基因簇涉氧化应激、凋亡信号、白细胞活化、内吞与NOD-like receptor信号，提示由稳态向活化/应激态转变。
3.7 CellChat分析预测GenX后小胶质细胞-神经元通讯改变：GenX组推断互作数与强度略增；NRXN、NCAM等突触相关信号及Cx3cl1-Cx3cr1神经免疫轴、Gas6-Mertk吞噬相关轴通讯概率改变，预测小胶质细胞与神经元在突触稳态、免疫监视和吞噬清除中的配体-受体网络紊乱。
3.8 胶质与内皮细胞出现神经退行及屏障相关通路改变：星形胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质前体细胞的差异基因GO涉突触组织、认知、钙转运、内吞调节，KEGG富集阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩侧索硬化及钙、PI3K-Akt、Ras、Rap1、cAMP信号；内皮细胞富集氧化应激、细胞连接组装、紧密连接、局灶黏附、黏附连接等屏障相关通路。
讨论部分总结方面，研究人员指出该研究首次用snRNA-seq系统刻画慢性GenX暴露后脑内细胞响应，证实GenX在血、肝、脑蓄积并破坏肠屏障与BBB；神经元神经退行/凋亡、小胶质细胞NLRP3/Caspase-1炎症活化、P2ry12下调与Apoe上调的态转换，以及NRXN、NCAM、Cx3cl1-Cx3cr1、Gas6-Mertk通讯改变共同构成神经毒性机制链条。作者也说明人群血清GenX通常低于本小鼠模型、人脑组织监测稀缺，故结果支持的是所试暴露条件下的危害与机制，不能直接外推典型环境暴露风险；行为中运动下降可能干扰认知任务解释；单剂量、仅雄性、单终点、CellChat与拟时序为计算推断系主要局限。
研究结论部分翻译：在本研究中，研究人员通过行为学评估、靶向UPLC-MS/MS分析、snRNA测序与分子生物学验证，系统研究了慢性经口GenX暴露的神经毒性效应。结果表明，慢性GenX暴露导致GenX在血液、肝脏和脑组织中显著蓄积，并伴随肠屏障与血脑屏障破坏。此外，GenX暴露引起多类脑细胞广泛转录改变，尤其神经元与小胶质细胞；神经元群体富集神经退行与凋亡相关通路，小胶质细胞-神经元通讯模式改变。本研究提供了慢性GenX暴露后脑内细胞响应首个全面单核转录组学刻画。PFAS日益被认为可在多器官蓄积并穿透生物屏障，从而致全身毒与神经损伤；本研究GenX剂量参照既往体内研究，UPLC-MS/MS确认长期暴露后全身分布与脑内穿透。但人群生物监测血清GenX通常低于本模型，人脑可比监测稀少，故发现揭示的是所试实验暴露条件下GenX的神经毒危害与生物学机制，直接外推至典型人类环境暴露水平神经风险须谨慎。既往研究提示PFAS可扰乱内皮完整性与紧密连接蛋白；本研究同样见Evans blue外渗增加及Occludin、ZO-1、Claudin下降，内皮细胞富集紧密连接、局灶黏附、黏附连接通路，说明屏障失调与GenX脑蓄积可能促成神经元损伤与神经炎症，但是否顺序发生或系独立反应需进一步研究。神经元功能障碍与凋亡是环境神经毒性的重要病理特征；本研究慢性GenX暴露后认知与运动行为异常、神经元神经退行通路富集、Bax/Bcl-2与cleaved Caspase-3改变，均支持GenX神经毒；但神经元凋亡是否直接介导行为异常仍待研究。小胶质细胞活化是神经炎症与神经元损伤关键；本研究小胶质比例增加、Aif1/Tyrobp/Cd68/Fcgr2b/Itgb2上调、NLRP3/Caspase-1与促炎因子升高、P2ry12下降与Apoe上升，表明向疾病相关/应激态转变。CellChat预测NRXN、NCAM、Cx3cl1-Cx3cr1、Gas6-Mertk等轴改变，反映突触稳态、神经免疫监视与吞噬清除紊乱。除神经元与小胶质细胞外，星形胶质细胞、少突胶质细胞及少突胶质前体也出现突触组织、认知、钙转运、内吞与钙/PI3K-Akt/Ras/Rap1/cAMP信号改变，说明GenX神经毒不限于两类细胞而是广谱胶质失调。研究人员强调行为、屏障、蓄积为直接表型，蛋白验证支持炎症/凋亡/屏障分子变化，而富集、拟时序与CellChat为假设生成性计算分析，需实验验证。局限包括单剂量、仅雄性、运动损伤干扰认知任务、拟时序非真实时间进程、CellChat为计算推断、因果链未完全阐明及核水平分析未完全处理同鼠核间依赖；未来需更大队列、伪 bulk分析与多性别多剂量研究。总体而言，慢性GenX暴露通过屏障功能障碍、神经元凋亡、小胶质细胞炎症活化及小胶质细胞-神经元通讯预测性改变诱导广谱神经毒性，为新兴PFAS替代物长期暴露的神经系统风险提供了新机制见解。
