纳米硒（Nano-Se）通过抑制铜死亡（cuproptosis）恢复线粒体自噬流（mitophagic flux）并缓解脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）诱导的鸡肾脏炎症

《Environment International》：Nano-selenium suppresses cuproptosis to restore mitophagic flux and alleviate deoxynivalenol-induced renal inflammation

　　

纳米硒（Nano-Se）抑制铜死亡（cuproptosis）以恢复线粒体自噬流（mitophagic flux）并缓解脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）诱导的肾脏炎症。Nano-Se缓解DON诱导的鸡肾脏cuproptosis。Nano-Se通过抑制cuproptosis减轻DON诱导的线粒体氧化损伤。Nano-Se通过抑制线粒体氧化损伤防止DON诱导的溶酶体膜通透性（lysosomal membrane permeabilization，LMP）和mitophagic flux阻断。Nano-Se通过恢复mitophagic flux减轻DON诱发的肾脏炎症。

论文解读：Nano-Se通过cuproptosis-mtROS-mitophagy轴缓解DON诱导的鸡肾损伤

霉菌毒素污染是公共卫生、食品安全和动物生产面临的重要挑战。脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON，一种常见霉菌毒素）是食品和饲料中最常见的污染物之一，可对人和家畜产生毒性。DON在谷类作物中广泛检出，全球小麦污染率约为60%-70%，中国部分饲料样本中检出率可达96.4%。DON生物利用度高，经肠道快速吸收并分布至多个器官，可诱导肠毒性、肾毒性和肝毒性。肾脏是DON代谢和排泄的主要器官，尤其易受其毒性影响。DON暴露可破坏肾脏形态、损害线粒体功能、促进炎症，并扰乱肾小管细胞自噬流。尽管多种程序性细胞死亡通路参与DON诱导的肾病，但新近认识的调控性细胞死亡通路，尤其是铜死亡（cuproptosis，一种铜依赖性、以线粒体电子传递链功能异常和脂酰化蛋白聚集为特征的调控性细胞死亡）在其中的作用，及其与线粒体功能障碍和炎症的关系，仍不清楚。

铜死亡可伴随线粒体电子传递链（electron transport chain，ETC）异常、铜依赖性脂酰化蛋白聚集和蛋白毒性应激，FDX1参与该过程，并伴随铁硫簇（iron-sulfur，Fe-S）蛋白失稳。已有证据表明，铜死亡常伴随线粒体活性氧（mitochondrial reactive oxygen species，mtROS）产生增加，而mtROS可触发细胞应激并损害线粒体完整性。肾脏，尤其是代谢活跃、富含线粒体的近端小管细胞，对金属稳态紊乱高度敏感。铜稳态失调已涉及急性肾损伤、糖尿病肾病和慢性肾脏病。然而，DON诱导的肾毒性是否涉及铜稳态紊乱和铜死亡相关线粒体损伤尚待探索。线粒体自噬（mitophagy）是选择性自噬，负责清除受损线粒体，对维持线粒体功能和细胞稳态至关重要。肾小管细胞因线粒体含量高和代谢需求高而尤其依赖该过程。过量mtROS可诱导溶酶体膜通透性（lysosomal membrane permeabilization，LMP）并损害溶酶体降解能力，从而破坏线粒体自噬流（mitophagic flux，受损线粒体经自噬体递送至溶酶体降解的动态过程）。线粒体自噬流受损会导致功能异常线粒体积累，进一步放大线粒体损伤和炎症信号。尽管铜死亡直接涉及铜依赖性线粒体蛋白毒性应激，并常伴随mtROS积累，但其对线粒体自噬流及下游炎症的潜在影响仍不清楚。硒是必需微量元素，可限制组织金属积累并缓解金属诱导毒性；纳米硒（Nano-Se）较传统硒化合物具有更高生物利用度和更低毒性，并具有抗氧化、抗炎活性。但Nano-Se能否缓解DON诱导的肾毒性，以及其保护作用是否靶向铜死亡介导的mtROS积累、线粒体自噬流损害和炎症，仍有待探索。

研究人员建立鸡和鸡胚肾（chicken embryo kidney，CEK）细胞DON暴露模型，并设置Nano-Se干预，评估Nano-Se对DON诱导肾毒性的保护机制。研究通过苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，H&E）染色和透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）评估肾脏组织病理和超微结构改变，通过定量实时PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）、免疫印迹（western blotting）和免疫荧光分析铜死亡、ETC复合物、线粒体自噬、溶酶体功能和炎症关键分子；并用CuCl₂、rotenone和bafilomycin A1（BafA1）分别激活铜死亡、诱导线粒体氧化损伤和阻断线粒体自噬晚期。研究结论表明，DON暴露通过激活cuproptosis-mtROS-mitophagy轴诱导鸡肾脏炎症，Nano-Se通过抑制铜死亡、恢复线粒体和溶酶体稳态、重建线粒体自噬流并减轻肾脏炎症，从而有效防止DON诱导的肾损伤。该研究发表于《Environment International》，不仅拓展了对霉菌毒素毒性机制的理解，将铜死亡引入兽医毒理学领域，也为霉菌毒素污染的营养干预策略提供了新见解；鉴于DON在食品和饲料链中广泛存在，这些发现可能对畜牧生产、食品安全和公共卫生具有更广泛意义。作者为Fengyi Zhang、Rongke Hu、Wenqi Sun、Bendong Shi、Yujie Yao。

为开展该研究，关键技术方法包括：以48只1日龄Arbor Acres（AA）肉鸡为动物样本，适应7天后随机分为Ctrl、Nano-Se、DON、DON+Nano-Se四组，每组8只；基础日粮含0.2 mg/kg亚硒酸钠，Nano-Se为0.5 mg/kg，DON为10 mg/kg，处理28天。CEK细胞来自18日龄SPF鸡胚（Harbin Veterinary Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences），选用0.2 μmol/L DON和0.1 μg/mL Nano-Se共处理24 h。主要技术包括H&E、TEM、qRT-PCR、western blotting、免疫荧光、ELISA、CCK-8、生化/离子/氧化应激检测、MitoSOX/MitoTracker检测mtROS、TMRE检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）、LysoTracker/MitoTracker检测线粒体-溶酶体共定位及mCherry-GFP-LC3B检测自噬流；并使用CuCl₂、rotenone和BafA1进行药理干预。

研究结果部分如下。3.1 Nano-Se ameliorates DON-induced renal injury in chicken。研究人员通过肾脏形态、体重、肾脏器官指数、血清CRE、BUN、KIM-1、H&E、TEM及CEK细胞活力检测发现，DON暴露导致肾脏萎缩和充血、增重降低、肾脏器官指数下降，并升高血清CRE和KIM-1而不显著影响BUN；组织病理显示肾小管上皮细胞坏死、出血和炎症细胞浸润，肾损伤评分升高；超微结构显示线粒体空泡化以及溶酶体、线粒体自噬体和线粒体溶酶体积累。Nano-Se处理明显缓解上述改变。CEK细胞中DON的IC₅₀为0.7624 μmol/L，0.2 μmol/L DON下细胞存活率为74.79%，0.1 μg/mL Nano-Se可显著改善细胞活力。结果表明Nano-Se可保护DON诱导的肾脏和CEK细胞损伤。

3.2 Nano-Se mitigates DON-induced renal cuproptosis in chicken。通过检测铜和硒含量、铜转运和铜死亡相关基因及蛋白、免疫荧光发现，DON增加肾脏组织和CEK细胞铜含量并降低硒水平，Nano-Se可恢复二者水平，CuCl₂可消除Nano-Se的调节作用。铜水平与血清KIM-1正相关，硒水平与之负相关；铜水平与CEK细胞活力负相关，硒水平与之正相关。DON上调CTR1、STEAP4、FDX1和DLAT mRNA，下调ATP7A、LIPT1和LIAS mRNA；蛋白水平上，DON增加CTR1、FDX1和不溶性DLAT，降低可溶性DLAT和LIAS。Nano-Se部分逆转这些变化，而CuCl₂取消其作用。免疫荧光显示DON减弱肾脏组织CTR1和FDX1荧光强度，并破坏CEK细胞中LIAS与Tom20共定位，Nano-Se逆转该异常，CuCl₂再次抵消。结果表明Nano-Se可缓解DON诱导的离子失衡和铜死亡。

3.3 Nano-Se attenuates DON-induced renal mitochondrial oxidative damage and TCA cycle impairment by suppressing cuproptosis in chicken。通过氧化应激指标、ETC蛋白、三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）相关代谢物、mtROS和MMP检测发现，DON增加MDA、H₂O₂和LPO，降低GSH、CAT和SOD，并抑制ETC复合物III的UQCRC2和复合物I的NDUFB8。DON还扰乱TCA循环稳态，表现为上游中间产物pyruvate和α-KG积累、下游代谢物succinate耗竭，并升高SAM水平。Nano-Se可恢复氧化还原平衡、ETC蛋白表达和代谢物水平，而CuCl₂减弱其保护作用。线粒体功能检测显示DON增强mtROS生成并降低MMP，Nano-Se明显缓解，CuCl₂削弱该效应。结果表明Nano-Se通过抑制铜死亡改善DON诱导的氧化还原失衡、线粒体氧化损伤和TCA循环紊乱。

3.4 Nano-Se alleviates DON-induced renal lysosomal dysfunction and membrane permeabilization by attenuating mitochondrial oxidative damage in chicken。通过检测V-ATPase亚基、组织蛋白酶、溶酶体标志物、LysoTracker荧光和线粒体-溶酶体共定位发现，DON降低肾脏组织和CEK细胞中ATP6V1A、ATP6V1B2和ATP6V1D的mRNA和蛋白表达，降低CTSB、CTSD和LAMP2表达，并促进CTSB、CTSD从溶酶体释放，提示LMP。Nano-Se恢复上述表达并改善溶酶体功能。mtROS诱导剂rotenone部分取消Nano-Se对V-ATPase亚基、组织蛋白酶和溶酶体标志物的恢复作用。DON降低LysoTracker荧光强度并破坏线粒体-溶酶体共定位，Nano-Se增强该细胞器互作，rotenone减弱该作用。结果表明Nano-Se至少部分通过限制mtROS过量产生来减轻DON诱导的溶酶体功能障碍和LMP。

3.5 Nano-Se relieves DON-induced renal mitophagic flux blockade by restoring lysosomal function in chicken。通过检测线粒体自噬标志物和mRFP-GFP-LC3报告系统发现，DON增加肾脏组织和CEK细胞中LC3、p62、Beclin-1、Pink1和Parkin的mRNA和蛋白表达，提示线粒体自噬成分积累；Nano-Se共处理部分逆转这些变化，提示线粒体自噬周转恢复。BafA1抑制V-ATPase后消除Nano-Se在CEK细胞中的调节作用。免疫荧光中Pink1和Parkin变化与蛋白表达一致。mRFP-GFP-LC3检测显示，DON增强GFP荧光并积累黄色斑点，表明线粒体自噬体-溶酶体融合或溶酶体降解受损；Nano-Se增加红色斑点，反映线粒体溶酶体形成增强和线粒体自噬流改善；BafA1阻断该效应。结果表明Nano-Se通过恢复V-ATPase依赖性溶酶体功能缓解DON诱导的线粒体自噬流阻断。

3.6 Nano-Se attenuates inflammatory response by relieving DON-induced mitophagy blockade。通过炎症因子含量、mRNA和蛋白表达、免疫荧光及主成分分析发现，DON增加肾脏组织中IL-1β、TNF-α和IFN-γ，降低IL-10；Nano-Se显著减轻促炎因子升高并恢复抗炎因子。mRNA和蛋白水平变化一致，免疫荧光显示DON组TNF-α和IL-1β信号增强，Nano-Se处理后降低。CEK细胞中DON同样增加IL-1β、TNF-α、IFN-γ和IL-6，降低IL-10；Nano-Se有效逆转，而BafA1消除Nano-Se效应。mRNA、蛋白和免疫荧光趋势一致。主成分分析显示Ctrl和Nano-Se组聚集较近，DON组形成独立簇，DON+Nano-Se组位于二者之间，DON+Nano-Se+BafA1组向DON簇回移。结果表明Nano-Se通过恢复自噬流减轻DON诱导的炎症反应。

讨论部分指出，DON广泛存在于食品和饲料中，口服后迅速分布至血浆、肾脏和小肠，肾脏作为DON代谢和排泄的主要器官尤其易受损。硒是维持氧化还原稳态和细胞内金属离子平衡的重要微量元素，Nano-Se较传统硒具有更优生物活性和更低毒性。既往研究表明Nano-Se可通过调节离子紊乱、氧化应激、线粒体自噬和炎症缓解肾损伤，但其对抗DON肾毒性的疗效和机制尚不明确。本研究中，Nano-Se补充通过抑制铜死亡介导的线粒体氧化损伤、LMP、线粒体自噬流阻断和炎症，缓解DON诱导的肾损伤。肾脏对微量元素稳态扰动敏感，DON增加肾脏铜含量并降低硒水平，Nano-Se恢复二者，且铜水平与肾损伤标志物正相关、硒水平负相关。铜死亡由细胞内铜过载驱动，CTR1、ATP7A和STEAP4是铜稳态相关蛋白；DON增加CTR1和STEAP4、降低ATP7A并升高铜水平，提示铜稳态破坏。过量铜可结合脂酰化蛋白，促进其聚集并使Fe-S簇蛋白失稳，诱导蛋白毒性应激和铜死亡。FDX1是蛋白脂酰化中心调节因子，其上调促进DLAT脂酰化依赖性聚集，促进铜结合TCA循环蛋白并激活铜死亡；LIAS作为硫辛酸合成酶参与线粒体蛋白脂酰化所需硫辛酰辅因子生成。DON暴露后FDX1上调、DLAT聚集、LIAS下调，反映蛋白脂酰化稳态破坏和肾脏铜死亡发生；Nano-Se逆转这些变化，CuCl₂削弱其作用。铜过载还可通过Fenton样反应促进氧化损伤，Cu⁺与H₂O₂反应生成Cu²⁺和高度反应性羟自由基（•OH），诱导脂质过氧化并加重细胞氧化损伤。铜死亡主要靶向线粒体，FDX1参与线粒体铜还原和蛋白脂酰化。DON增加mtROS并降低MMP，减少ETC复合物NDUFB8和UQCRC2，提示线粒体氧化应激和功能损害。pyruvate、α-KG和succinate是TCA循环和ETC关键中间物，SAM是LIAS依赖性硫辛酸合成和线粒体蛋白脂酰化底物；DON导致pyruvate、α-KG和SAM积累，succinate耗竭，说明线粒体能量代谢紊乱及TCA循环与ETC协调受损。Fe-S蛋白参与TCA循环和ETC，其受损可部分解释两通路协调异常。Nano-Se恢复mtROS、MMP、ETC复合物表达和TCA代谢物水平，CuCl₂消除其对线粒体功能的保护，表明Nano-Se通过抑制铜死亡减轻DON诱导线粒体功能障碍。

线粒体自噬对限制mtROS积累至关重要。线粒体损伤时，Pink1积累于外膜并招募Parkin启动线粒体蛋白泛素化，p62识别泛素化底物并与LC3相互作用，促进自噬体包裹受损线粒体，Beclin-1参与自噬起始复合物形成。本研究中DON增加Pink1和Parkin表达，提示线粒体损伤后线粒体自噬激活；同时LC3和Beclin-1上调，p62积累，提示线粒体自噬体形成已启动，但线粒体自噬流在降解阶段受阻。p62积累是自噬流受损标志。Nano-Se明显减轻DON诱导的Pink1、Parkin、LC3、Beclin-1和p62上调，提示线粒体自噬流恢复和受损线粒体清除增强。BafA1干预消除Nano-Se保护作用，进一步证实Nano-Se增强线粒体自噬依赖有效下游自噬体降解。溶酶体通过介导受损线粒体降解确保线粒体自噬流，溶酶体酸化主要依赖V-ATPase活性。DON下调ATP6V1A、ATP6V1B2和ATP6V1D，提示溶酶体功能受损，并促进CTSB和CTSD从溶酶体释放，提示LMP；LysoTracker荧光降低和线粒体-溶酶体共定位减少进一步说明DON损害溶酶体酸化和线粒体向溶酶体递送，最终阻断线粒体自噬流。Nano-Se恢复溶酶体酸化、增加V-ATPase亚基表达、减少CTSB和CTSD泄漏并缓解线粒体自噬流阻断；rotenone取消Nano-Se对线粒体自噬流的激活，提示Nano-Se通过抑制线粒体氧化应激介导的溶酶体功能障碍改善DON诱导的线粒体自噬流抑制。线粒体自噬流受损可放大炎症信号，DON增加TNF-α、IL-1β和IL-6，降低IL-10；Nano-Se逆转这些改变，而BafA1消除其保护作用并再次升高促炎因子，提示抑制自噬降解破坏Nano-Se介导的抗炎作用。综上，Nano-Se至少部分通过恢复线粒体自噬流和清除受损线粒体减轻DON诱导的肾脏炎症。

研究结论翻译：综上，DON暴露通过激活cuproptosis-mtROS-mitophagy轴诱导鸡肾脏炎症。Nano-Se通过抑制铜死亡、恢复线粒体和溶酶体稳态、重建线粒体自噬流并减轻肾脏炎症，有效防止DON诱导的肾损伤。本研究不仅拓展了对霉菌毒素诱导毒性机制的认识，将铜死亡引入兽医毒理学领域，也为霉菌毒素污染的营养干预策略提供了新见解。鉴于DON在食品和饲料链中广泛存在，这些发现可能对畜牧生产、食品安全和公共卫生具有更广泛意义。