《Molecular Pain》：Electroacupuncture alleviates inflammatory pain through AMPK-autophagy signaling and suppression of iNOS and IL-1β in inflamed tissues
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电针（Electroacupuncture, EA）可有效缓解炎性疼痛，但其潜在机制尚未完全阐明。新近证据表明AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）与自噬（autophagy）参与调节炎症反应，但二者是否介导
电针（Electroacupuncture, EA）可有效缓解炎性疼痛，但其潜在机制尚未完全阐明。新近证据表明AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）与自噬（autophagy）参与调节炎症反应，但二者是否介导EA的镇痛作用尚不清楚。本研究验证了以下假说：EA通过激活巨噬细胞中的AMPK，进而触发自噬并抑制炎症组织中促炎介质iNOS与IL-1β的表达，从而缓解炎性疼痛。在完全弗氏佐剂（Complete Freund’s Adjuvant, CFA）诱导的小鼠炎性疼痛模型中，研究人员评估了EA处理后的疼痛行为与炎症标志物变化。采用药理学调节剂——AMPK拮抗剂Compound C、AMPK激动剂AICAR以及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine, 3-MA）——来解析AMPK-自噬-细胞因子级联反应。利用携带自噬报告基因（stubRFP-sensGFP-LC3慢病毒）的NR8383巨噬细胞进行体外实验，进一步验证该通路。EA不仅减轻了CFA诱导的痛觉过敏，还同步增强了损伤皮肤中AMPK磷酸化水平、提升了自噬通量，并降低了iNOS与IL-1β的水平。与之呼应，单用AICAR即可产生镇痛效果、增强自噬并降低细胞因子表达。相反，Compound C阻断了EA对自噬和炎症标志物的作用，而3-MA则消除了EA的镇痛与抗炎效应。巨噬细胞实验证实了体内结果，确证AMPK激活驱动自噬并进而抑制iNOS/IL-1β。研究人员的发现确立了一条机制轴：EA作用于巨噬细胞中的AMPK以上调自噬，后者进而抑制iNOS与IL-1β的产生，最终缓解炎性疼痛。该工作揭示了EA抗伤害感受效应的新型细胞通路，并将AMPK-自噬轴凸显为疼痛管理中的潜在治疗靶点。
研究背景与科学问题
炎性疼痛是重要的临床问题。非甾体抗炎药（NSAIDs）虽常用，但存在胃肠道出血、认知功能下降等副作用。针灸可有效缓解退行性膝骨关节炎、慢性腰痛、分娩痛及癌痛且无上述副作用。AMP活化蛋白激酶（AMPK）是重要的镇痛靶点，其激活可增强自噬，而自噬与镇痛密切相关。自噬是一种降解受损细胞器、改善应激条件下细胞存活的过程，多项研究表明其在缓解疼痛中发挥重要作用。既往研究发现，电针（EA）可通过激活背根神经节（DRG）中的AMPK促进自噬，从而对神经病理性疼痛发挥镇痛作用。此外，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）介导大量一氧化氮的产生，参与神经传递和免疫应答；活化的巨噬细胞释放的炎性细胞因子如白细胞介素-1β（IL-1β）在炎性疼痛中起关键作用。然而，EA如何通过调控AMPK来抑制炎症因子从而改善炎性疼痛的机制尚不明确。因此，本研究旨在验证以下假说：EA通过激活AMPK促进巨噬细胞自噬，抑制炎症皮肤组织中IL-1β和iNOS的表达，从而缓解炎性疼痛。
研究方法概述
研究人员采用完全弗氏佐剂（CFA）皮下注射建立小鼠炎性疼痛模型（雄性C57BL/6小鼠，8-9周龄）。应用韩氏穴位刺激仪于足三里（ST36）和上巨虚（ST37）进行电针（EA）治疗（强度1 mA，频率2 Hz，每次30分钟，每日一次，连续6天）。通过Von Frey纤维丝和热板实验分别检测机械性和热痛阈值。采用蛋白质印迹法（Western blotting）检测皮肤组织及NR8383大鼠巨噬细胞系中p-AMPK、AMPK、LC3、p62、iNOS和IL-1β的蛋白水平。通过免疫荧光共标记技术观察CD68阳性巨噬细胞中p-AMPK、iNOS和IL-1β的表达。使用药理学工具：AMPK抑制剂Compound C（腹腔注射，20 mg/kg）、AMPK激动剂AICAR（局部注射，20 μg/20 μL）及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）（腹腔注射，15 mg/kg）进行通路干预。体外实验中，利用stubRFP-sensGFP-LC3双荧光慢病毒感染NR8383细胞以监测自噬流变化。
研究结果
EA减轻CFA诱导的炎性疼痛并激活炎症皮肤组织中的AMPK和自噬
与对照组相比，CFA组小鼠机械缩足阈值和热板潜伏期从第2天至第7天显著降低。EA处理显著提高CFA小鼠的机械阈值和热板潜伏期，而假EA无效。EA对侧足阈值无影响。蛋白结果显示，EA显著增加炎症皮肤中p-AMPK（Thr172位点磷酸化）水平，而对总AMPK无影响。CFA组LC3-II/I比值低于对照组、p62水平升高，提示自噬处理受损；EA显著逆转这些变化，即升高LC3-II/I比值并降低p62水平，表明EA增强炎症皮肤中的自噬。
EA抑制CFA诱导的炎症皮肤中致痛介质表达
CFA组皮肤组织中iNOS和IL-1β蛋白水平显著高于对照组。EA处理显著降低二者的表达，而假EA无此效应。
Compound C预处理逆转EA的镇痛作用及对巨噬细胞中iNOS和IL-1β的抑制
Compound C预处理阻断EA对CFA小鼠机械和热痛觉过敏的缓解作用。Compound C显著降低EA升高的p-AMPK水平，并逆转EA对LC3-II/I比值的升高和对p62的降低作用，表明EA通过激活AMPK促进自噬。同时，Compound C逆转EA对iNOS和IL-1β的抑制作用。免疫荧光共定位显示，EA显著降低CD68阳性巨噬细胞中iNOS和IL-1β的表达，Compound C则消除这一效应，提示EA通过激活AMPK抑制炎症皮肤巨噬细胞中iNOS和IL-1β的表达。
AMPK激动剂缓解炎性疼痛、促进自噬并抑制炎症皮肤中iNOS和IL-1β
单次皮下注射AICAR显著缓解CFA诱导的机械和热痛觉过敏，镇痛效应持续超过4小时。AICAR显著升高LC3-II/I比值，降低p62、iNOS和IL-1β水平，模拟了EA的效果。
AMPK激活促进NR8383巨噬细胞自噬并抑制iNOS和IL-1β表达
在CFA处理的NR8383细胞中，LC3-II/I比值降低、p62升高，iNOS和IL-1β上调。AICAR预处理逆转这些变化，而Compound C取消AICAR的作用。双荧光自噬报告基因实验显示，AICAR减少绿色斑点数量（代表自噬溶酶体形成增多），表明自噬流增强，Compound C则阻断此效应。这证实AMPK激活通过促进自噬发挥抗炎作用。
自噬抑制剂3-MA阻断EA对炎性疼痛及iNOS和IL-1β表达的影响
3-MA预处理逆转EA对CFA小鼠机械和热痛觉过敏的缓解作用。3-MA也逆转EA对iNOS和IL-1β的抑制作用，表明自噬介导EA的抗炎效应。
讨论与结论
研究讨论指出，AMPK作为能量传感器，其激活可抑制多种炎症通路。EA可能通过激活AMPK/SIRT1通路促进脊髓中巨噬细胞/小胶质细胞的M2极化。本研究中，EA显著激活AMPK并缓解炎性疼痛，该效应被Compound C逆转，这与既往研究一致。研究首次发现CFA诱导的炎症皮肤组织中自噬处理受损，EA促进该过程，且Compound C可阻断EA对自噬的激活，提示EA激活AMPK后促进自噬参与镇痛。外周巨噬细胞产生的IL-1β和iNOS是重要致痛介质。EA通过激活AMPK和自噬，抑制巨噬细胞中iNOS和IL-1β的表达。自噬可靶向降解pro-IL-1β，从而减少成熟IL-1β的产生。iNOS在炎症巨噬细胞中高表达，产生一氧化氮加剧疼痛，EA通过AMPK-自噬途径下调iNOS。研究也指出了局限性：热板实验无法独立评估同侧与对侧差异，未来可采用Hargreaves法；Compound C腹腔注射可能导致全身暴露，不能排除其对神经元和胶质细胞等其他细胞类型的作用；EA的镇痛机制是减少巨噬细胞浸润还是直接调控其活化/极化状态尚待阐明；后续将使用小鼠来源的RAW 264.7巨噬细胞进行研究。
研究结论翻译
总之，本研究提供了新的信息：EA可以通过激活AMPK并随后促进炎症皮肤组织中的自噬，从而抑制巨噬细胞中iNOS和IL-1β的表达。这一作用拓展了研究人员对EA镇痛机制的理解，并支持EA用于治疗炎性疼痛的临床应用。
