《Frontiers in Marine Science》：On the effectiveness of two universal metabarcoding primer pairs in amplifying Arctic gelatinous zooplankton DNA from tissue and environmental samples
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胶质浮游动物（gelatinous zooplankton, GZP）是一个高度多样化的海洋类群，在全球海洋中扮演着重要的生态角色。然而，其脆弱的身体结构使得传统的采样方法（如网采和光学调查）难以对其进行有效研究。尽管近年来非侵入性DNA宏条形码（DNA me
胶质浮游动物（gelatinous zooplankton, GZP）是一个高度多样化的海洋类群，在全球海洋中扮演着重要的生态角色。然而，其脆弱的身体结构使得传统的采样方法（如网采和光学调查）难以对其进行有效研究。尽管近年来非侵入性DNA宏条形码（DNA metabarcoding）技术的发展已成为GZP生物多样性研究的重要工具，但常用的宏条形码标记在这些类群中的表现仍知之甚少。本研究评估了两对通用引物对——靶向18S rRNA V1–V2区域和线粒体COI Leray基因区域——在检测关键北极GZP物种中的效能。研究人员通过in silico PCR、in vitro PCR及组织来源DNA测序，以及受控模拟群落（mock community）实验中的环境DNA（environmental DNA, eDNA），对引物性能进行了评估。COI引物提供了高分辨率的物种级分类鉴定，但未能扩增若干水螅类物种和环带栉水母（cydippid ctenophores）。相比之下，18S引物扩增了更广泛的类群，但缺乏足够的分辨率来区分密切相关的属和种。研究人员还发现公共参考数据库中存在显著缺口，这限制了北极GZP的准确鉴定，并最终提供了额外的条形码序列以扩展公共数据库中的现有覆盖范围。这些发现证明了常用COI和18S标记的互补优势与局限性，并为标记选择及新遗传标记的探索提供了指导，以支持基于DNA的北极GZP监测。鉴于气候变化驱动的分布范围变化已观测到并预计将持续，这对于调查这些难以捉摸的生物至关重要。
一、研究背景与问题提出
胶质浮游动物（GZP）是一类高度多样且多系起源的海洋生物类群，涵盖被囊动物（脊索动物门）、栉水母（栉水母门）和水母（刺胞动物门）。尽管历史上常被排除在浮游动物调查之外，近年研究已证实它们在海洋生态系统和食物网中扮演重要角色。然而，其胶质身体和多态生命周期使其极易在网采或拖网等侵入性采样中受损或被完全遗漏。光学调查虽为非侵入性方法，但依赖可辨识的形态特征，限制了高分辨率鉴定。在环境条件严酷的北极海域，多种GZP物种预计将因气候变化加剧（包括海水升温）而经历显著分布范围变迁，但对其群落组成、分布和丰度的认知仍十分有限。
近年来，组织分子条形码及环境DNA（eDNA）和食性样本的宏条形码技术已成为调查脆弱类群的重要工具。北极地区多项基于eDNA和胃内容物的宏条形码研究已揭示GZP作为鱼类、端足类和十足类饵料的重要地位，且eDNA consistently能检出网采和光学调查遗漏的类群。然而，宏条形码研究的成败关键取决于遗传标记和引物对的选择——引物与目标物种DNA之间的错配、PCR偏差以及参考数据库缺口均可能导致假阴性和物种丰富度低估。针对多系起源的浮游动物类群，通常采用"通用"标记以确保最大多样性捕获，其中18S核糖体小亚基rRNA基因（18S）和线粒体COI基因最为常用。18S因保守性而具有广泛扩增能力，但分辨力有限，多数后生动物仅能鉴定至目或科水平；COI Leray片段则因进化速率快而具有更强的物种级分辨能力。尽管两种标记均已在北极GZP研究中应用，但某些类群持续被COI漏检的原因究竟是引物偏差还是参考数据库缺口，此前尚不清楚。鉴于GZP在北极生态系统中的重要性以及多标记研究相较单标记更高的成本，确定纳入18S核糖体标记是否能实际提升区域GZP物种检出率，具有重要意义。
二、研究内容与主要结论
研究人员针对上述知识缺口，通过构建包含北极GZP物种的现场模拟群落，系统评估了COI和18S两种常用宏条形码引物对的性能。研究首先评估了目标物种在两个主要公共参考数据库中的覆盖度，其次通过in silico PCR评估引物结合效率，然后在网捕标本组织DNA上测试引物，最后在模拟群落eDNA上进行宏条形码测试。研究得出以下核心结论：COI Leray引物提供高物种级分辨率但存在引物错配和参考序列缺口问题；18S V1–V2引物具有广泛类群覆盖但分辨率不足；北极GZP的公共参考数据库覆盖存在显著缺口；两种标记具有互补优势与局限，标记选择应取决于研究目标和目标分类分辨率。
三、关键技术方法
研究采用以下主要技术方法：in silico PCR（利用Geneious软件Primer3功能，基于MZGdb和BOLD数据库下载的18S和COI序列进行引物结合测试）；组织DNA提取与Sanger测序（使用QIAGEN DNeasy试剂盒提取，扩增全长18S rRNA基因和COI Folmer片段及Leray片段）；模拟群落eDNA实验（18个个体代表五个刺胞动物科和栉水母纲Tentaculata，在14 L海水中孵育约40小时，过滤收集eDNA）；宏条形码文库制备与高通量测序（18S V1–V2和COI Leray-XT采用两步PCR，COI另设一步PCR连接方案，Illumina NovaSeq PE250测序）；生物信息学处理（COI数据采用OBITOOLS 3流程，18S数据采用DADA2流程，分别进行去噪、嵌合体去除、空白校正和分类注释）。样本来源为2021年PS126航次在弗拉姆海峡HAUSGARTEN观测站HG-IX站位（79°07.967'N 002°45.607'E）采集的标本。
四、研究结果
4.1 北极GZP公共数据库覆盖度：根据MZGdb数据，北极海域常见122种水螅类、10种钵水母和7种栉水母。序列覆盖度以水螅类最低（COI: 50%；18S: 40%），栉水母次之（COI: 71%；18S: 85%），钵水母最高（COI: 100%；18S: 80%）。BOLD数据库检索（2025年12月18日）返回174条公开条形码，覆盖15种、四个基因。模拟群落物种中，A. digitale的COI参考序列最多（9条北极序列），E. dunlapae完全无公开COI序列。18S方面，所有目标物种均至少有一条参考序列。
4.2 In silico PCR引物评估：COI Leray-XT引物对74条参考序列（8个物种）测试中，正向引物（mlCOIintF-XT）对所有物种均结合成功；反向引物（jgHCO2198）除Solmundella bitentaculata和S. arctica外均至少有一条序列结合成功。多数错配（4个）发生在正向引物结合位点，主要见于A. digitale和Pleurobrachia pileus。18S V1–V2引物对28条序列（12个物种）测试中，S. arctica双向结合均失败，Atolla tenella因序列长度不足无法评估正向引物，其余物种均成功结合且无引物错配。
4.3 组织DNA测序：COI Folmer片段仅3/16个标本成功测序，其中仅A. digitale鉴定至物种水平；Leray片段12/16个标本成功测序，6个鉴定至物种水平，1个至科水平，5个无匹配。18S全长基因和V1–V2片段均对全部16个标本成功测序，但除A. digitale外，所有其他标本均存在多个属或更高分类单元显示相同或极高相似度匹配（>99.5%），无法进行准确的属和种级界定。
4.4 模拟群落eDNA宏条形码：COI-A数据集（两步PCR）检出10个GZP MOTU，COI-B（一步PCR）检出12个；除栉水母和管水母D. arctica外，其余目标类群均被检出。COI-B额外检出A. digitale但丰度极低（占GZP读数的1%）。18S数据集检出54个GZP ASV，代表21个不同分类单元，所有模拟群落类群均被检出，但S. arctica仅鉴定至科水平（Rhopalonematidae），D. arctica仅属级检出。非目标GZP类群（如Cyanea capillata）在两个标记中均有低丰度检出，研究人员归因于标本作为"天然采样器"携带的残留DNA。
五、讨论与结论
讨论部分指出：参考数据库覆盖不足是GZP宏条形码的主要限制因素，尤其水螅类在北极的条形码覆盖极低；in silico分析虽显示两种引物对具有高结合率，但in vitro结果受数据库质量和覆盖度影响；COI引物在组织DNA扩增中成功率低于18S，但Leray-XT引物表现优于Folmer引物；18S引物对所有标本均成功扩增且覆盖全部模拟群落科级类群，是唯一能扩增栉水母的标记；COI提供高置信度物种级鉴定，而18S受限于科级分辨率；A. digitale的Leray-XT引物错配（4个错配）被证实是其在北极宏条形码研究中持续假阴性的重要原因；COI读段丰度与生物量可能存在关联，而18S在重复样本间变异性更高，可能与其低拷贝数和PCR偏差敏感性有关。研究结论指出：COI Leray和18S V1–V2标记为北极GZP宏条形码提供互补信息——COI实现高分辨率物种鉴定但受引物错配和参考序列缺口限制，18S具有广泛类群覆盖但缺乏物种分辨力。多标记方法虽能提升科级覆盖，但不一定增加生态学意义上的物种级信息，且增加成本和解读复杂性。引物对和靶向片段的选择应取决于研究目标、目标分类分辨率和相关参考数据库覆盖度。研究最后强调，迫切需要加强公共参考数据库建设，特别是增加北极及邻近海域GZP类群的条形码测序工作，以实现DNA-based生物多样性评估在极地海洋生态系统中的全部潜力。
