《Frontiers in Immunology》：Integrated multi-omics and machine learning identify core mechanobiology-associated immune genes in pulmonary arterial hypertension
编辑推荐：
摘要
背景： 肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）以肺血管重塑和力学信号改变为特征，伴随该环境的免疫相关转录组变化尚未被完全阐明。
方法： 研究人员整合了肺组织批量测序数据（GSE15197）、外周血单个核细胞（
摘要
背景： 肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）以肺血管重塑和力学信号改变为特征，伴随该环境的免疫相关转录组变化尚未被完全阐明。
方法： 研究人员整合了肺组织批量测序数据（GSE15197）、外周血单个核细胞（PBMC）数据（GSE33463）及单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（GSE169471），并使用一套经过筛选的2,537个力学相关基因（mechanical-related genes，MRGs）。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）、最小绝对收缩和选择算子（LASSO）、随机森林及单细胞定位分析支持候选基因的优先排序。该四基因组合在野百合碱（monocrotaline，MCT）诱导的肺动脉高压（PH）大鼠模型及10例特发性肺动脉高压（IPAH）患者和10例对照的PBMCs中进行了验证。
结果： PAH转录组显示应力纤维、肌动球蛋白、细胞外基质（ECM）及免疫相关程序的富集。CD83、CD86、IL6和TLR7被优先筛选出来，并呈现区室依赖性表达模式。单细胞数据将CD83/CD86定位于髓系/抗原提呈细胞（APC）区室，将IL6定位于内皮/成纤维细胞群体；TLR7检出稀疏。在MCT处理的大鼠肺组织中，CD86和TLR7蛋白表达升高，而CD83和IL-6表达降低。临床PBMCs显示出相应的表达方向，每个基因的曲线下面积（AUC）均大于0.7。探索性四基因疾病状态评分的内部交叉验证AUC为0.765。
结论： 这四个候选基因为研究PAH中免疫-基质相互作用（包括对非感染性血管损伤的反应）提供了细胞和分子背景。该基因组合显示出中等的内部区分能力。这些发现支持进一步的临床和功能研究，但并未确立直接的机械转导靶点或连接力学应激与血管炎症的因果通路。
论文主体内容解读
一、研究背景与问题提出
肺动脉高压（PAH）是一种以肺血管收缩和重塑为特征的进行性肺疾病，全球每百万人中约有15至50人患病。其发病机制主要与内皮功能障碍以及成纤维细胞和平滑肌细胞的异常增殖相关。血管收缩、血管重塑、肺循环内皮功能障碍、炎症反应、氧化应激、心脏纤维化、病理性右心室重塑、细胞缺氧、代谢失衡和血栓形成共同参与了PAH的病理生理过程。尽管PAH特异性治疗方案的出现改善了特发性肺动脉高压（IPAH）患者的中位生存期，但长期生存结局仍不理想，其核心原因在于PAH发病机制复杂且尚未完全阐明，同时缺乏精确的早期诊断生物标志物和有效的治疗靶点。
力学信号对肌肉、细胞和器官的力学感知、发育过程、干细胞命运调控乃至肿瘤发生具有深远影响，在组织损伤的启动和修复中尤为关键。由于肺独特的呼吸动力学和结构特征，肺微环境表现出复杂的力学特性，使肺极易发生功能失调。研究表明，异常力学应激是PAH发生和进展的关键致病因素。肺小动脉内异常血流动力学变化导致血管壁力学应激增加，进而引起细胞外基质（ECM）成分和结构的显著变化——以硬度增加为特征——最终重塑其所包绕细胞的力学微环境。肺血管细胞可通过YAP/TAZ依赖性信号对ECM硬度作出反应，将力学线索与基质重塑联系起来。然而，当前PAH研究主要聚焦于血管活性因子和信号通路，针对力学相关基因（MRGs）的分子分型、预后评估和靶向干预研究仍然匮乏，异常力学信号调控PAH进展的具体分子机制尚未完全阐明。
值得注意的是，免疫基因的参与本身并不意味着PAH具有感染性病因。临床分类中既包括HIV相关和血吸虫病相关PAH，也包括特发性及其他非感染性类型。先天免疫反应也可由组织损伤过程中释放的内源性信号启动，实验证据表明损伤相关分子HMGB1和TLR4与肺血管重塑相关。因此，研究人员在血管损伤和力学改变的背景下审视免疫相关候选基因，而非预设感染性触发因素。
二、研究目的与开展的研究
本研究旨在通过整合批量肺组织转录组学、外周血单个核细胞转录组学和单细胞RNA测序数据，系统表征PAH中力学生物学相关的转录组重塑景观。研究人员构建了涵盖三个维度的力学相关基因集——力学微环境（MM）、细胞骨架与力产生（CF）、力学感知信号（MS）——并通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）、基于机器学习（ML）的候选基因优先级排序和单细胞定位分析，最终鉴定出一个经实验锚定的四基因组合（CD83、CD86、IL6、TLR7）。这四个基因的表达特征和诊断性能进一步在具有PAH样病变的野百合碱（MCT）诱导肺动脉高压（PH）大鼠模型和IPAH患者PBMC样本中得到验证。
三、主要关键技术方法
研究人员使用了多项关键技术方法。数据来源方面，批量肺组织转录组数据来自GSE15197数据集（Agilent GPL6480平台），分析队列包含18例PAH肺样本和13例非疾病对照肺；PBMC转录组数据来自GSE33463，包含41例健康对照和30例IPAH样本；人肺scRNA-seq数据来自GSE169471，质控后保留38,401个细胞（25,100个对照细胞和13,301个IPAH细胞）。分析方法包括：使用limma R包进行批量差异表达分析；使用Seurat包（v4.0）中Wilcoxon秩和检验进行单细胞差异表达分析；使用clusterProfiler R包对单细胞差异表达排序列表进行基因集富集分析（GSEA）；采用Brennecke型均值-方差模型在各力学类别中筛选高变基因（HVGs）；利用STRING数据库（版本11.5）构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并使用快速贪婪算法聚类；对批量肺转录组矩阵执行WGCNA以识别与PAH状态和力学活性相关的共表达模块；使用LASSO逻辑回归（glmnet，10折交叉验证）和随机森林（randomForest，500棵树）两种独立算法对111个可变PAH-MRG特征进行候选优先级排序；使用CellChat R包（版本1.5.0）和CellChatDB人配体-受体相互作用数据库进行信号分层细胞间通讯分析；通过Western blot和定量PCR（qPCR）进行蛋白和mRNA表达验证。临床样本方面，研究人员在河北医科大学第二医院收集了10例IPAH患者和10例年龄性别匹配的健康对照的PBMC样本。
四、研究结果
PAH表现出广泛的力学转录组重塑。 通过分析GSE15197批量肺数据，鉴定出PAH与对照肺之间4,398个差异表达基因（DEGs），其中2,571个上调、1,827个下调。对GSE169471单细胞数据的平行分析揭示2,793个DEGs，包括702个上调和2,091个下调基因。单细胞排序的GSEA显示力学力相关程序的强烈富集，代表性富集通路包括应力纤维组织、肌动球蛋白结构形成和ECM结构组成活性。交集分析表明批量DEGs和单细胞DEGs均与MM、CF和MS基因集显著重叠，表明PAH失调跨越细胞外微环境、细胞骨架-力和力学感知组分。
力学候选基因显示协调的功能和网络架构。 在DEGs与力学相关基因宇宙交集后，通过均值-方差校正和残差排序，最终获得111个独特的可变PAH-MRG。基因本体（GO）弦图显示所选基因富集于生物学相关的力学和免疫功能：MS类别与"对力学刺激的反应"相关，CF类别与"收缩性肌动蛋白纤维束组装"和"肌动蛋白介导的细胞收缩"相关，MM类别与"白细胞粘附"和"细胞外基质组织"相关。单样本GSEA（ssGSEA）显示所有六个方向性特征（MM上/下调、CF上/下调、MS上/下调）在FDR校正后均显著不同。STRING PPI网络分析产生高度互联的力学候选网络，快速贪婪聚类将其分离为包含ECM、细胞骨架、免疫粘附和力学感知组分的不同群落。
WGCNA恢复PAH相关的共表达背景。 样本聚类显示清晰的组结构，软阈值选择β=4（无标度R2>0.85，平均连通性约20），基因树状图切割产生14个不同的共表达模块。模块-性状相关分析将多个模块特征基因与PAH状态和力学活性评分联系起来，其中青绿色模块与CF相关力学评分呈最强正相关（相关系数=0.68，P=2e-04），绿色模块与MM和MS评分显著相关。基因显著性对模块成员关系分析显示青绿色模块内基因表现出协调的模块成员关系和疾病/力学关联（相关系数=0.877，P<1e-200）。核心模块基因（WGCNA模块基因与单细胞DEGs交集）包含40个基因，其GO富集以血红素、氧载体和气体转运术语、氧化应激反应以及先天免疫和粒细胞程序为主。
候选基因优先级排序。 候选漏斗将分析从2,537个来源基因缩减至524个PAH-MRG重叠基因、111个可变PAH-MRG基因、10个机器学习稳定计算候选基因，最终保留四个具有实验表达验证支持的基因（CD83、CD86、IL6、TLR7）。Shapley值分解显示IL6和CD86贡献最大的平均绝对Shapley值（分别为0.207和0.154），而TLR7和CD83贡献较小（分别为0.073和0.031）。四基因疾病状态评分显示留一法交叉验证AUC为0.765（95% CI：0.621-0.909），支持向量机敏感性分析得出一致的AUC为0.722。单基因水平上，诊断性能因组织区室而异：CD83（肺AUC=0.709，PBMC AUC=0.857）；CD86（肺AUC=0.808，PBMC AUC=0.440）；IL6（肺AUC=0.774，PBMC AUC=0.804）；TLR7（肺AUC=0.624，PBMC AUC=0.850）。跨层方向分析显示CD83、CD86和IL6在肺批量、PBMC和单细胞层中表现出大致可解释的方向模式，而TLR7表现出背景依赖性行为。
单细胞分析将基因组合定位于髓系/APC和结构区室。 单细胞注释解析出八种主要肺细胞群体，其中髓系/巨噬细胞为最大区室（对照细胞占57.6%，IPAH细胞占45.4%）。内皮细胞从对照的7.4%增加到IPAH的15.1%，肥大细胞从1.2%增加到3.9%。四基因组合显示细胞背景定位而非在所有肺细胞类型中均匀表达：CD83在47.3%的髓系/巨噬细胞和34.4%的B/浆细胞中检出；CD86在28.6%的髓系/巨噬细胞中检出；IL6在内皮和成纤维细胞等结构区室中更明显；TLR7在单细胞对象中检出稀疏。
四基因特征状态定义不同的细胞间通讯背景。 四基因模块评分将细胞分为特征高和特征低组进行细胞通讯分析。CellChat分析显示特征分层之间推断的相互作用数量和强度存在差异。相对和绝对信息流排序突出了COLLAGEN、APP、MIF、FN1、CXCL和CD99等通路。最强的通讯差异涉及髓系和基质区室，将四基因组合置于更广泛的髓系-结构通讯背景中。
MCT诱导PH大鼠模型的建立。 与对照组相比，MCT处理组大鼠的右心室收缩压（RVSP）显著升高，右心室肥厚（RVH）程度显著增加（RV/LV+S比值显著升高），肺动脉中膜厚度显著增大。Western blot检测显示，CD86和TLR7蛋白在PH模型大鼠肺组织中显著上调，而CD83和IL-6蛋白显著下调。
四个免疫生物标志物在PH大鼠和IPAH患者PBMCs中的验证。 在10例IPAH患者和10例健康对照的PBMC样本中，IPAH患者CD83和IL-6的表达浓度显著低于健康对照，而CD86和TLR7的表达浓度显著高于健康对照。ROC曲线分析显示四个基因的AUC值均大于0.7（CD83为0.7437，CD86为0.7049，IL-6为0.7079，TLR7为0.7012），表明这四个基因在该小型验证队列中显示出对IPAH的候选诊断潜力。
五、讨论与结论总结
在讨论部分，研究人员指出：转录组分析中应力纤维、肌动球蛋白和ECM程序的富集将候选基因组合置于力学改变的肺血管环境中，但富集和共表达并不能确立力学与炎症事件的时序关系。免疫激活在PAH中并不需要持续感染，非感染性血管损伤可通过内源性损伤相关分子模式（DAMPs）参与先天免疫。CD83和CD86提供抗原提呈细胞（APCs）与下游免疫反应之间的联系，其功能效应取决于受体参与和伴随的抗原提呈背景。IL-6通过膜结合或可溶性IL-6受体（IL6R）、gp130和JAK/STAT3信号提供炎症信号与肺血管重塑之间更直接的联系。TLR7作为内体RNA传感器，RNA自身抗原免疫复合物可将内源性RNA递送至该区室并诱导TLR7依赖性干扰素-α和IL-6产生，为TLR7激活提供了可能的非感染性途径。四基因疾病状态评分的LOOCV AUC为0.765，与已发表的PAH转录组特征相比属于中等水平，直接比较受组织来源、队列组成、特征选择和验证策略差异的限制。研究局限性包括：发现队列规模小（31例肺样本，18例PAH事件；111特征筛选的事件每变量比约为0.16）；横断面数据集无法确立时间关系或疾病进展；力学信息基因集成员资格和表达关联不能证明四个基因是直接力学传感器或YAP/TAZ或RhoA/ROCK的下游效应器；分析限于肺组织、PBMCs和单细胞肺数据。
研究结论翻译： 本研究通过力学生物学信息指导的转录组筛选和表达水平验证，将CD83、CD86、IL6和TLR7鉴定为免疫相关候选基因。它们的区室依赖性行为与PAH中免疫-基质相互作用的改变相容。关于内源性危险感知、抗原提呈和IL-6信号的已发表证据为免疫参与非感染性血管损伤提供了生物学依据。研究结果并未确立这四个基因构成因果通路或介导力学应激的效应。该基因组合仍是一个探索性疾病状态特征，需要独立的临床验证和靶向功能研究。
