经脊髓时序干扰刺激增强神经可塑性相关反应并促进小鼠脊髓损伤后运动恢复

《Frontiers in Neuroscience》：Transspinal temporal interference stimulation enhances neuroplasticity-associated responses and facilitates motor recovery after spinal cord injury in mice

　　

摘要 引言： 脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）会导致严重的运动功能障碍，其机制涉及神经元丢失、轴突断裂以及突触连接性受损。时序干扰（temporal interference，TI）刺激能够调节神经活动，但其在SCI中的治疗潜力在很大程度上仍未被探索。本研究探讨了TI刺激对SCI后功能恢复及神经可塑性相关反应的影响。 方法： 将32只C57BL/6J小鼠随机分为四组：假手术组、SCI组、假刺激组和TI刺激组。小鼠接受T8脊髓半切术，随后在损伤后第4天至第21天接受每日TI刺激。采用Basso小鼠量表（Basso Mouse Scale，BMS）评估运动功能恢复情况。在损伤后21天，通过免疫荧光染色和蛋白质印迹分析评估神经元相关变化、胶质细胞反应以及神经可塑性相关的分子变化。 结果： 与假手术小鼠相比，SCI小鼠表现出运动功能受损、NeuN阳性神经元密度降低，以及神经可塑性相关蛋白（包括GAP43、NF-L、SYN和PSD95）表达下降。相比之下，TI刺激显著改善了BMS评分，增加了NeuN阳性神经元密度，并伴随着轴突生长相关蛋白（GAP43和NF-L）以及突触可塑性相关标志物（SYN和PSD95）的表达增强。 讨论： 这些发现表明，TI刺激可改善SCI后的功能恢复，并且这种改善与增强的神经可塑性相关反应有关，包括轴突生长相关和突触可塑性相关的变化。本研究为TI刺激作为一种促进脊髓损伤后神经可塑性相关恢复过程的、有前景的神经调控策略提供了证据。

论文解读：经脊髓时序干扰刺激促进小鼠脊髓损伤后神经可塑性与运动恢复

一、研究背景与研究目的

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种严重的神经系统疾病，常导致持久的功能障碍，给患者和社会带来沉重的经济负担。SCI的病理生理过程复杂，包含原发性和继发性损伤两个阶段。原发性损伤表现为直接的神经元丢失、血管破坏、轴突横断和突触连接中断。随后，继发性损伤过程，如神经炎症、脱髓鞘、缺血反应和氧化应激，会进一步加剧组织损伤，并形成一个抑制轴突重塑和突触可塑性的微环境，从而限制神经功能的恢复。

轴突再生和突触重塑是SCI后神经功能恢复的关键过程，有助于重建中断的神经连接和功能性环路。然而，中枢神经系统的受损轴突再生能力有限，这归因于多种内在和外在的限制因素，包括缺乏允许轴突生长的环境、髓鞘和细胞外基质中存在抑制分子、反应性胶质细胞增生以及内在神经元生长程序激活不足。与此同时，SCI还会导致广泛的突触连接丧失，损害突触的形成、成熟和适应性可塑性。越来越多的证据表明，神经可塑性，包括轴突发芽和突触重组，在SCI后神经功能恢复中起着关键作用，这使得促进适应性环路重塑的策略具有巨大的治疗潜力。

鉴于受损神经系统固有的适应性重塑能力，多种治疗策略已被探索用于促进SCI后的神经修复和功能恢复。然而，基于干细胞的疗法面临着细胞存活率低以及与宿主神经回路整合不足等挑战，限制了其临床转化。因此，基于神经调控的干预措施因其调节神经回路和增强神经修复的潜力而受到广泛关注。现有的方法，如硬膜外电刺激（epidural electrical stimulation，EES）、经皮脊髓电刺激（transcutaneous spinal cord stimulation，TSCS）和重复经颅磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS），已显示出改善SCI后运动结果的潜力，但这些技术仍受限于侵入性、穿透深度不足、空间选择性有限以及难以精准靶向深部脊髓神经回路等问题。

时序干扰（temporal interference，TI）刺激是一种新兴的神经调控策略，它利用两束高频交流电的相互作用，在目标组织中产生一个低频包络调制电场，从而实现对目标神经组织的空间选择性调控，同时减少对周围组织的非预期激活。近期研究表明，TI刺激可以调节神经元兴奋性并影响神经可塑性过程，可能通过调节突触蛋白表达、神经递质释放、树突棘重塑和突触囊泡动力学来实现。这些研究暗示TI刺激可能具备调控神经可塑性的能力，但这种效应能否转化为SCI后与神经修复相关的结构和分子变化尚不清楚。因此，本研究旨在探讨经脊髓TI刺激是否能促进SCI后的运动功能，以及这些效应是否与NeuN阳性神经元密度的变化以及轴突生长相关和突触可塑性相关反应的调节有关。

二、主要关键技术方法

研究人员使用了成年雌性C57BL/6J小鼠（6-8周龄，来源于贵州超宇生物科技有限公司），建立了T8脊髓右侧半切模型。TI刺激方案采用绝缘针电极，置于T6（阳极）和T9（阴极）椎旁的脊髓区域，施加频率为2 kHz和2.02 kHz、振幅均为0.6 mA的两路交流电，产生20 Hz的时序干扰包络。刺激从损伤后第4天开始，每天一次，持续至第21天，共18次。采用Basso小鼠量表（BMS）评估后肢运动功能恢复。通过免疫荧光染色检测GFAP、NeuN、PSD95和SYN的表达，并使用Fiji软件进行定量分析。通过蛋白质印迹法检测GAP43、NF-L、PSD95和SYN的蛋白表达水平。

三、研究结果

1. TI刺激改善SCI后的后肢运动功能恢复

通过BMS评分评估后肢运动功能。双因素重复测量方差分析显示时间与分组之间存在显著的交互作用。在损伤后1天，所有损伤组BMS评分均显著低于假手术组。在损伤后7天，各组间无显著差异。但在损伤后14天和21天，TI刺激组（SCI+TI）的BMS评分显著高于SCI组和假刺激组（SCI+SS）。这表明TI刺激能够有效促进SCI后的运动功能恢复。

2. TI刺激减轻SCI后的神经元丢失相关变化

在损伤后21天，通过GFAP和NeuN的免疫荧光染色评估星形胶质细胞活化和神经元丢失。SCI诱导后，SCI组和假刺激组的GFAP阳性面积显著增加，而NeuN阳性神经元密度显著降低。TI刺激后，SCI+TI组的NeuN阳性神经元密度较SCI组和假刺激组显著升高。虽然GFAP阳性面积在TI刺激后呈现下降趋势，但未达到统计学显著性。这表明TI刺激可能减轻了SCI后的神经元丢失。

3. TI刺激增强SCI后的突触可塑性相关蛋白表达

在损伤后21天，通过PSD95和SYN的免疫荧光染色评估突触可塑性相关变化。与假手术组相比，SCI导致PSD95和SYN的荧光强度降低。TI刺激后，SCI+TI组的PSD95和SYN平均荧光强度较SCI组和假刺激组显著升高。这表明TI刺激增强了SCI后的突触可塑性相关蛋白表达。

4. TI刺激增加SCI后轴突生长相关和突触可塑性相关蛋白的表达

在损伤后21天，通过蛋白质印迹法检测GAP43、NF-L、PSD95和SYN的表达水平。结果显示，与假手术组相比，SCI组和假刺激组的这些蛋白表达均降低。TI刺激后，SCI+TI组的GAP43、NF-L、PSD95和SYN的表达水平均得到恢复，显著高于未治疗的损伤组。这表明TI刺激增强了SCI后的轴突生长相关和突触可塑性相关反应。

四、讨论与结论

本研究发现TI刺激能显著改善不完全性SCI小鼠的后肢运动功能恢复，并伴随NeuN阳性神经元密度增加，以及轴突生长相关蛋白（GAP43、NF-L）和突触可塑性相关蛋白（PSD95、SYN）表达水平的升高。这些分子变化表明，TI刺激可能增强了SCI后的轴突生长相关反应和突触可塑性相关过程。尽管TI刺激已在脑深部调控和外周神经调控中展现出潜力，但本研究首次在小鼠T8脊髓半切模型中，采用2,000 Hz和2,020 Hz载波频率，从行为学、组织学和分子层面证实了TI刺激对SCI后神经可塑性相关反应的促进作用，为TI刺激作为一种有前景的脊髓损伤后神经调控策略提供了新的实验证据。

研究结论：研究人员发现，TI刺激可改善不完全性SCI后的功能恢复，这种改善伴随着NeuN阳性神经元密度的增加以及轴突生长相关和突触可塑性相关蛋白表达的增强。