单细胞水平探究干扰素与系统性红斑狼疮疾病发作的关联

《Frontiers in Immunology》：Investigating the association between interferons and flares of systemic lupus erythematosus at a single cell level

背景： 干扰素（IFN）水平升高是系统性红斑狼疮（SLE）的一个标志性特征，并与疾病发作相关，但其背后的确切机制尚不清楚。研究人员在单细胞分辨率下，探究了干扰素刺激蛋白（ISPs）与发作期及静止期SLE患者免疫变化之间的关联。 方法： 利用质谱流式细胞术（CyTOF），在来自18名健康对照（HC）、24名静止期SLE患者和46名近期发作期SLE患者的外周血单个核细胞（PBMC）群体中，检测了六种ISPs。研究人员评估了单个ISP及一个复合ISP评分。 结果： 对29个免疫群体的分析显示，平均ISP水平与外周血干扰素刺激基因（ISG）表达相关，且在发作期患者中高于静止期患者。尽管存在这种相关性，ISP表达在不同细胞亚群之间及亚群内部均表现出异质性。为确定导致这种异质性的因素，研究人员比较了每位受试者中ISP表达最高的细胞与其余细胞。高ISP表达细胞具有更高的转运标志物表达，且表达模式各异，提示这些细胞可能曾穿越不同组织。除β7外，这些分子并非由IFN在体外诱导。纵向分析显示，随着发作缓解，T细胞和活化固有免疫群体中的ISP表达逐渐下降，而B细胞群体中的ISP表达保持稳定，其基线水平可预测一年后持续或复发的疾病活动。 结论： 尽管大多数细胞群体中的平均ISP表达与整体ISG表达相关，但SLE中免疫群体之间及内部存在异质性，这可能反映了细胞在体内穿越炎症部位时经历的IFN暴露差异。

论文解读

研究背景与目的

系统性红斑狼疮（SLE）是一种慢性系统性自身免疫病，具有显著的发病率和死亡率。其临床高度异质性，多数患者呈现复发-缓解的病程，伴有不可预测的发作期（flares）和静止期。产生自身抗体，尤其是抗核抗体（ANAs），是SLE的标志，这些抗体可沉积于组织并引发炎症。尽管B细胞及其后代——抗体分泌细胞在发病机制中起关键作用，但驱动疾病发作的免疫机制尚未完全阐明。

大多数SLE患者外周血中干扰素刺激基因（ISG）表达升高，且与疾病活动性相关。治疗性给予I型IFN可在少数个体中诱发狼疮样疾病，而ANA阳性个体中高水平的IFNα或ISG表达与进展为临床疾病的可能性增加相关。纵向研究显示，高基线ISG表达或IFNα水平与随后发作风险增加及未来5年更严重的疾病相关。然而，全血中的ISG表达无法区分不同的IFN暴露细胞亚群，且丰度较高的群体可能对整体ISG水平贡献更大。单细胞RNA测序研究提示，不同的循环免疫细胞群体具有独特的ISG特征，高ISG特征亚群的扩增可能与疾病活动性相关。

本研究利用一个独特的急性发作期和静止期患者纵向队列，通过检测干扰素刺激蛋白（ISPs）作为ISG表达的替代标志物，在全血IFN特征与单细胞ISP表达之间建立联系，旨在探究IFN水平升高促进SLE免疫失调和疾病发作的细胞机制。

研究方法概述

研究人员从多伦多大学狼疮诊所招募了46名近期发作期、24名静止期SLE患者及18名ANA阴性健康对照（HC），并纵向收集了其中20名患者的随访样本。研究采用质谱流式细胞术（CyTOF）检测外周血单个核细胞（PBMCs）中六种ISPs（ISG15、IFIT3、MX1、PKR、IRF7、BST2）的表达，通过无监督聚类识别出29个免疫细胞群体。利用NanoString技术检测全血中三个ISG基因簇（ISG.1、ISG.2、ISG.3）的表达评分。此外，通过体外IFN刺激实验验证ISPs的诱导性。统计分析包括差异丰度分析（diffcyt-DA-edgeR）、差异状态分析（diffcyt-DS-limma）、Spearman相关性分析及ROC曲线分析等。

研究结果

建立可利用CyTOF在单细胞水平检测ISP表达的抗体组合：

研究人员构建了一个包含六种ISPs抗体的41标志物CyTOF组合，识别出29个免疫细胞群体，包括7个B细胞亚群、12个T细胞亚群、4个单核细胞亚群、2个NK细胞亚群、3个树突状细胞（DC）亚群及低密度粒细胞（LDG）。细胞丰度分析显示，SLE患者中过渡性B细胞、年龄相关B细胞（ABC）、调节性T细胞、经典单核细胞群1和3、LDG等群体较HC显著增加，其中经典单核细胞和ABC在发作期患者中更为丰富。UMAP显示，ISP表达在HC中最低，静止期居中，发作期最高，且单核细胞、DC、活化/调节性T细胞和浆母细胞（PB）的ISP水平高于其他群体。

大多数免疫群体的ISP表达水平与外周血ISG评分强相关，且发作期高于静止期患者：

体外实验证实，IFNα和IFNβ可强烈诱导所有免疫群体的ISPs表达，而IFNγ的诱导作用微弱。各细胞群体中标准化ISP水平之间及其与三个全血ISG评分之间均存在强相关性，其中与ISG.1的相关性最强，与ISG.3最弱。在所有细胞类型中，发作期患者的复合标准化ISP评分均显著高于静止期患者，且在调整种族因素后，27/29个群体仍保持显著差异。

单个细胞群体内可见ISP表达的异质性：

在ABC和Tph细胞群体中，ISPs倾向于协调表达，平均表达呈近似单峰分布，但部分受试者出现高ISP表达细胞的第二峰或肩峰。经典单核细胞3和mDC则表现出更宽的ISP表达分布，在高ISG和低ISG患者中均存在明显的高、低ISP表达细胞模式。体外IFN刺激仅诱导单峰分布，未能重现体内观察到的双峰模式，提示体内ISP表达的异质性可能源于细胞暴露于IFN的差异或其他改变其IFN响应能力的信号。

转运和活化差异可能解释细胞对IFN响应能力的异质性：

在记忆B和T细胞群体中，高ISP表达（ISP^hi）亚群显著富集转运标志物（β7、CCR9、CLA、L-选择素），且这些标志物在不同细胞中大多呈互斥表达，而肠道归巢标志物CCR9和β7呈弱但一致的共表达。体外IFN刺激仅诱导β7（中至强度）和L-选择素（弱）表达，CCR9和CLA未被显著诱导。这表明ISP^hi细胞可能已从不同炎症组织转运而来，而非IFN直接诱导转运标志物。

Tph细胞中CLA表达与发作期皮肤受累相关：

发作期伴有皮疹的患者，其CLA^hi Tph细胞比例显著高于无皮疹患者（中位数3.20% vs 0.96%）。在6个月随访时，大多数皮疹消退，CLA^hi Tph细胞频率也显著下降。一例基线无皮疹的患者在6个月时CLA^hi Tph细胞升高，随后在1年内出现皮疹。这提示循环中部分ISP^hi细胞可能反映曾转运通过炎症组织的细胞，可提供器官特异性炎症的信息。

ISP表达的纵向变化及其与疾病活动变化的关系：

对20名患者的纵向随访显示，基线发作期患者在6个月和1年时ISP评分无显著变化，但在3年时，活化/效应T细胞亚群、Tph和Tfh细胞及部分活化固有免疫群体（活化pDC、非经典/中间单核细胞、经典单核细胞3）的ISP评分显著下降。相比之下，B细胞亚群的ISP表达在整个随访期间保持稳定。当所有患者合并分析时，大多数免疫群体中基线ISP水平与1年后的疾病活动相关；但当按基线状态分层后，仅B细胞亚群中升高的基线ISP表达与1年后的疾病活动相关。ROC分析显示，LDG中PKR（AUC=0.8）、未转换记忆（USM）B细胞中IRF7（AUC=0.783）和ABC中ISG15（AUC=0.774）的ISP表达对预测1年后疾病活动具有最佳效能。

讨论与结论

研究表明，六种ISPs在体内外均协调表达，与整体ISG特征呈中至强相关，可作为I型IFN活性的细胞读数。ISP表达与ISG.1相关性最强，与ISG.3最弱，后者富含IFNγ诱导基因，而本研究的ISPs均不被IFNγ强诱导，提示这些ISPs是I型而非II型IFN诱导基因表达的优良替代标志物。

患者个体内免疫群体中显著的ISP表达异质性，结合体外IFN刺激产生均一反应的结果，支持ISP表达差异源于可变IFN暴露、可能与细胞转运相关的假说。ISP^hi记忆细胞富集转运标志物、转运标志物互斥表达、以及IFN不诱导多数转运标志物等证据，均支持ISP^hi细胞可能已转运通过炎症组织。CLA^hi Tph细胞与活动性皮肤受累的关联及其随皮疹消退而下降，进一步支持这一概念。

纵向分析显示，发作期患者T细胞和活化固有免疫群体的ISP表达在3年时显著下降，而B细胞和LDG的ISP水平保持稳定。B细胞群体中稳定的ISP表达及其对1年后疾病活动的预测能力，提示IFN对B细胞的作用可能在促进SLE疾病活动中发挥重要作用。研究还发现，ABC中ISP表达的预测能力优于单独测量ABC丰度或整体ISG表达。

研究存在若干局限性，包括CyTOF组合中转运标志物不全面、组织特异性表现患者代表性有限、发作期与静止期队列种族构成差异、以及未直接证明ISP^hi细胞在组织中的转运。未来需结合配对血液和组织样本的单细胞RNA测序、空间分析及BCR/TCR测序，以进一步验证这些发现。

研究结论： 尽管大多数细胞群体中的平均ISP表达与整体ISG表达相关，但SLE中免疫群体之间及内部存在异质性，这可能反映了细胞在体内穿越炎症部位时经历的IFN暴露差异。B细胞亚群中稳定的ISP表达及其对后续疾病活动的预测能力，提示针对B细胞的IFN效应机制在SLE疾病活动中具有重要作用。