《Animal Diseases》：Multigenerational stability and environmental safety of transgenic rice expressing a dimeric HN protein as a plant bioreactor for poultry Newcastle disease vaccine antigen production
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新城疫（Newcastle disease, ND）仍是家禽中经济影响最为严重的病毒性疾病之一，亟需开发新型耐热、低成本且与基因VII型匹配的兽用疫苗平台，以克服传统疫苗依赖冷链储运、应用成本高以及对当前流行基因VII型毒株交叉保护不足等局限性。水稻胚乳凭借其
新城疫（Newcastle disease, ND）仍是家禽中经济影响最为严重的病毒性疾病之一，亟需开发新型耐热、低成本且与基因VII型匹配的兽用疫苗平台，以克服传统疫苗依赖冷链储运、应用成本高以及对当前流行基因VII型毒株交叉保护不足等局限性。水稻胚乳凭借其生产成本低、抗原可脱离冷链储存、生物量产量高以及在禽类口服或饲料免疫方面具有巨大潜力，已成为兽用疫苗抗原生产的理想植物生物反应器。本研究在隔离田间条件下，系统评价了表达新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）二聚体血凝素-神经氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase, HN）抗原的两个独立转基因水稻品系（HN-1和HN-2）在T1–T3世代的综合表现，旨在筛选用于大规模生产ND疫苗抗原的优良植物生物反应器品系。外源HN基因在基因组中整合稳定，其编码区未检测到序列变异，并在连续三个世代中维持一致的转录和蛋白表达水平。农艺学检测表明，HN-1品系的主要农艺性状和稻米品质性状与野生型TP309高度一致，而HN-2品系的稻米垩白缺陷具有明确的品系特异性。未检测到外源基因向邻近杂草的可检测水平基因漂移，转基因品系的花粉活力、种子萌发性能和非靶标节肢动物多样性均未发生改变。综上，HN-1品系具备优异的遗传稳定性、农艺适应性和生态安全性，可作为工业化生产NDV HN疫苗抗原的优良植物生物反应器候选品系。本研究为水稻来源兽用ND疫苗的进一步开发和监管评价提供了遗传稳定性、农艺表现及初步生物安全数据支持。
论文解读
一、研究背景与科学问题
新城疫（Newcastle disease, ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）引起的禽类急性、高度接触性病毒性疾病，对全球养禽业造成重大经济损失，被世界动物卫生组织（WOAH）列为须通报疫病，在我国被列为一类动物疫病。NDV编码两种关键表面糖蛋白，其中血凝素-神经氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase, HN）蛋白是重要抗原，在病毒受体识别和入侵中发挥关键作用。鉴于基因VII型NDV毒株的广泛流行，HN已成为开发新型基因型匹配禽用疫苗的首选抗原靶标。
目前商业化ND疫苗主要包括灭活疫苗、弱毒活疫苗和病毒载体疫苗。然而，由于NDV的遗传多样性和持续进化——尤其是基因VII型毒株的广泛流行——传统疫苗的交叉保护率往往低于30%。此外，传统疫苗依赖冷链储运且需多次免疫，增加了成本并限制了大规模推广应用，尤其在资源有限地区。迄今为止，尚无商业化的植物来源ND亚单位兽用疫苗正式上市，凸显了对替代性低成本、耐热且易于应用的疫苗生产平台的迫切需求。
植物表达系统已成为重组兽用疫苗抗原生产的先进且有前景的生物反应器平台，具有高生物安全性、大规模生产能力和低下游加工成本等独特优势。在众多植物表达载体中，水稻胚乳因其遗传稳定性高、遗传转化体系成熟、胚乳蛋白积累能力强以及抗原可在室温长期储存而无需冷链等特性，特别适合作为兽用疫苗开发的优选生物反应器。此外，水稻种子来源抗原可直接作为饲料添加剂用于禽类口服免疫，有效降低大规模养殖场的免疫应激和人工成本。
前期研究构建了头尾相连的二聚体HN（Osr2HN）抗原，并验证了水稻表达的二聚体HN蛋白可为鸡只提供针对NDV攻毒的完全临床保护，确认了水稻来源HN抗原的免疫原性潜力。然而，该概念验证研究未解决将植物生物反应器平台转化为兽用疫苗生产和监管应用的三个不可或缺的前提条件：（1）外源疫苗抗原基因的多世代遗传稳定性；（2）适合大规模标准化种植和抗原批量生产的优良农艺性能；（3）转基因疫苗作物的田间环境生物安全评价。为填补兽用疫苗转化研究中的这一空白，本研究在隔离田间条件下系统评价了表达NDV二聚体HN抗原的两个转基因水稻品系（HN-1和HN-2）在T1–T3世代的表现。
二、主要关键技术方法
研究人员利用全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）技术，通过Oxford Nanopore Technologies（ONT）长读长测序平台对T1–T3世代转基因水稻进行插入位点分析和结构变异检测，并对外源HN基因编码区进行深度变异分析。采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）确认转基因在基因组DNA中的存在，利用实时荧光定量PCR（quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR）检测HN基因在叶片中的转录水平，通过Western blot（WB）和HN特异性免疫层析试纸条对成熟种子中HN蛋白的积累和抗原效价进行定性和半定量检测。农艺性状和稻米品质评价涵盖12项核心性状，采用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）观察稻米胚乳淀粉粒微观结构。环境安全评价方面，通过PCR检测邻近杂草中外源基因的漂移情况，采用黄粘板诱捕法调查田间节肢动物多样性，并设置样方调查杂草多样性。所有转基因材料均在新疆昌吉中国农业科学院综合试验基地的隔离田间条件下种植，以野生型粳稻品种TP309（国际水稻研究所编号IRGC 42576）为对照。
三、研究结果
HN转基因在多世代中的稳定整合。 全基因组测序证实HN-1和HN-2两个品系在T1–T3世代均存在外源HN基因的稳定整合，与水稻参考基因组的比对率介于96.22%至99.78%之间，参考序列覆盖率为98.31%–98.38%，平均测序深度为25.5×至39.3×。插入位点分析揭示了一致的染色体间易位：1号染色体（Chr1）上32,680,503–32,681,743 bp区域在三个世代中均易位至3号染色体（Chr3）。插入/易位位点的上边界定位于Chr1: 32,681,743 bp（位于AGIS_Os01g048210基因内含子内），下边界定位于Chr3: 31,802,579 bp（位于AGIS_Os03g046780和AGIS_Os03g046790之间的基因间区）。对靶向读段的深度变异分析显示，任何世代中HN基因编码区均未发生序列变异。
HN抗原在DNA、RNA和蛋白水平的稳定表达。 PCR分析确认T1–T3转基因植株穗部和叶片基因组DNA中存在HN基因，而野生型TP309无相应条带。qRT-PCR显示两个转基因品系各世代叶片中均可检测到HN转录本，相对表达量约为野生型对照的8至400倍，但未观察到随世代变化的表达趋势，较宽的表达范围可能反映个体间差异或转基因整合的位置效应。Western blot分析在T1–T3转基因品系成熟种子中检测到HN蛋白积累，野生型TP309无目标条带。HN特异性免疫层析试纸条半定量检测显示，三个世代的相对抗原效价恒定维持在1:29。
农艺表现：HN-1接近野生型，HN-2呈现品系特异性垩白。 对与生长、产量和稻米品质相关的12项核心农艺性状在T1–T3世代进行了评价。HN-1品系在T2世代12项性状中均与野生型TP309无显著差异；T1世代仅穗长略短（P<0.05），T3世代仅有效穗重显著降低（P<0.05），其余性状均与野生型相当。HN-2品系在多个世代的部分性状出现显著差异：T1世代结实率显著低于野生型，T2世代穗长和有效穗重降低，T3世代有效穗重和千粒重显著增加。在稻米粒形参数（粒长、粒宽、粒厚、糙米率）方面，两个转基因品系与野生型均无显著差异。然而在垩白性状方面，HN-1在所有世代中垩白粒率和垩白度均无显著变化，而HN-2品系在T1–T3世代中垩白粒率和垩白度均显著且一致地增加（P<0.05或P<0.01）。扫描电子显微镜观察显示，野生型TP309和HN-1种子中的淀粉粒呈规则多面体形态、排列紧密且粒径均匀；而HN-2垩白胚乳中的淀粉粒不规则、较大且排列松散。
萌发、出苗、发育周期与生殖适合度。 HN-1、HN-2与野生型TP309在T1–T3世代的种子萌发率和出苗率均无显著差异，所有品系萌发率均高于90%，出苗率亦高于90%。从播种到成熟的整个生育周期为150至180天，未发现品系特异性差异。花粉活力方面，在花药采集后0、3和6小时经碘-碘化钾染色评估，转基因品系与野生型在各世代均无显著差异，正常可育花粉比例随时间保持稳定且各品系间相当。
初步环境安全评价。 为评估潜在基因漂移，研究人员收集了转基因水稻小区邻近多种杂草的叶片并进行PCR分析。在本次研究的单次时间点采样和有限实验条件下，任何邻近杂草样本中均未检测到HN转基因的扩增。地上节肢动物多样性方面，在乳熟期（虫压通常最高的时期）于野生型和转基因小区放置黄粘板，3天后各小区捕获的鳞翅目昆虫数量显著高于其他节肢动物类群，但TP309、HN-1和HN-2小区间的昆虫物种丰富度和丰度无显著差异。需要指出的是，该调查为初步观察性评估，采样范围和监测周期有限，但在这些限制条件下，未检测到与HN-1或HN-2相关的明显不良环境影响。
四、讨论与结论
本研究从兽用疫苗抗原生产和植物生物反应器转化应用的角度，系统评价了表达NDV二聚体HN蛋白的两个转基因水稻品系的多世代遗传稳定性、抗原表达一致性、农艺表现和初步环境安全性。HN-1品系在三个世代中表现出稳定的转基因遗传和恒定的HN抗原表达，农艺性状和稻米品质与野生型相当，且在隔离田间未观察到明显的生态风险。这些关键发现填补了水稻来源ND兽用疫苗开发的三个关键临床前空白：持续抗原生产所需的稳定遗传背景、大规模种植的农艺适应性以及监管推进所需的初步田间生物安全证据。
与前期工作相比，本研究进一步拓展了Ma等人（2024）的概念验证研究——该研究确认了水稻表达二聚体HN抗原对鸡只的保护效力，但缺乏多世代稳定性和田间适应性评价。据研究人员所知，这是首次针对ND疫苗抗原生产专用HN表达转基因水稻进行系统的T1–T3田间遗传和农艺稳定性评价。与叶片型植物系统相比，水稻胚乳生物反应器在兽用疫苗制造方面具有突出优势，包括单位生物量抗原积累量更高、下游纯化更简单以及抗原可在环境温度下长期维持活性，完美契合农村养殖地区无冷链禽类免疫的需求。
两个转基因品系中检测到的染色体间易位是农杆菌介导转化通过非同源末端连接（nonhomologous end joining, NHEJ）途径产生的常见副产物。值得注意的是，该易位未破坏内源功能基因，也未引起HN编码区任何突变，保证了疫苗抗原基因长期生产的遗传完整性。叶片组织并非转基因表达的目标组织，HN转录本在叶片中的个体间差异主要源于复杂插入伴随染色体易位所导致的表观遗传调控以及胚乳特异性启动子的低水平渗漏表达。然而，种子抗原效价在不同植株和世代间保持一致，多世代稳定性结论基于种子蛋白而非叶片转录本。垩白表型严格为HN-2品系特异性而非HN-1，表明T-DNA插入位置效应导致HN-2胚乳淀粉结构异常。HN-1品系优于HN-2的综合表现确认了其作为优良植物生物反应器候选品系的资格。
水稻胚乳平台作为新型兽用疫苗生物反应器，在ND防控方面具有三大突出优势：（i）低成本可规模化制造——水稻种植成熟且高度可扩展，疫苗抗原生产所需基础设施投入极小；（ii）冷链独立性——种子储存的HN抗原在室温下保持生物活性，大幅降低偏远养殖地区的物流成本；（iii）口服饲料免疫的可行性——含HN抗原的水稻种子可直接混入日常饲料，实现便捷的群体免疫，减少养殖场的注射应激和人工投入。
本研究存在以下局限性：环境安全评价在单一地点、单一生长季和小规模小区进行，尚不足以满足正式转基因兽用生物制品生物安全审批标准，仍需多点多年试验；未评价土壤微生物群或地下非靶标生物，且不能完全排除低水平长期基因漂移；极端田间胁迫（如干旱和高温）下的抗原表达稳定性尚未测试；HN-1品系来源HN抗原的免疫学性能需要独立的动物试验验证其作为合格兽用疫苗原材料的适用性。
研究结论：在本试点研究中，研究人员综合评价了表达NDV二聚体HN蛋白的两个转基因水稻品系作为禽用疫苗抗原生产候选植物生物反应器的表现。外源HN疫苗抗原基因在T1–T3世代实现了稳定的基因组整合和转录及蛋白水平的一致表达，编码序列无变异。检测到的染色体易位未损伤内源功能基因，也未改变HN基因完整性。HN-1品系表现出类似野生型的农艺性能和稻米品质，具备大规模种植和疫苗抗原批量生产的优良适应性。在隔离田间条件下，未检测到外源基因向周围杂草的基因漂移，转基因水稻对植物和节肢动物非靶标生物无显著不良影响。研究结果确认HN-1是生产NDV HN疫苗抗原的优良植物生物反应器候选品系，为后续疫苗候选筛选提供了重要的遗传、农艺和初步生物安全数据。仍需进一步的多点多年田间验证和鸡只免疫攻毒试验，以支持水稻来源兽用新城疫疫苗的长期生物安全评价和产业转化应用。
