16S rRNA基因扩增子与宏基因组分析揭示永久分层湖Lake Suigetsu层特异性微生物群落及异养细菌分布

《Limnology》：Layer-specific microbial community structures in the meromictic lake, Lake Suigetsu, unveiled by 16S rRNA gene amplicon and metagenomic analyses

　　

永久分层湖（meromictic lakes）因稳定的氧化还原分层支持多样化代谢过程，可作为研究微生物介导生物地球化学循环的天然实验室。Lake Suigetsu是日本典型永久分层湖，其特征为永久氧跃层（oxycline）将含氧微咸混合层（mixolimnion）与缺氧含盐产硫化物单对流层（monimolimnion）分隔。近期，Lake Suigetsu垂直细菌组成，尤其是自养菌（autotrophs）、硫化物氧化菌（sulfide oxidizers）和硫酸盐还原菌（sulfate reducers），受到显著关注。然而，对微生物群落，尤其是通过降解有机物参与生物地球化学循环的丰富异养菌（heterotrophs），仍知之甚少。为表征Lake Suigetsu生物地球化学循环，研究人员利用16S rRNA基因扩增子测序分析，在可区分物种和/或种内群体的扩增子测序变异体（amplicon sequencing variants, ASVs）水平上研究Lake Suigetsu各层微生物群落结构。研究人员揭示层特异性微生物群落，并且除先前报道的自养菌外，各层均存在丰富异养菌。在上部单对流层样本中，未培养的Anaerolineaceae细菌占据约20%相对丰度，该菌可能为厌氧异养菌。在混合层，最丰富者为SAR11细菌，相对丰度约6%。在氧跃层，最丰富的可能异养原核生物为未培养Ectothiorhodospiraceae细菌，相对丰度约5%，而四种最丰富原核生物由自养细菌组成并占据超过43%相对丰度，明显提示氧跃层中初级生产占优势。该研究为Lake Suigetsu中层依赖性、原核生物介导的生物地球化学循环提供了见解。

研究人员围绕永久分层湖（meromictic lake）中微生物介导的碳硫循环展开研究。水生环境生物地球化学循环主要由分解代谢驱动；含氧表层以需氧呼吸和产氧光合作用为主，表层以下沉降有机物支持厌氧代谢，微生物利用硝酸盐、硫酸盐等替代电子受体。永久分层湖具有稳定氧化还原分层，混合层（mixolimnion）与永久缺氧单对流层（monimolimnion）之间由氧跃层（oxycline）分隔，被称为天然实验室。Lake Suigetsu是日本典型永久分层湖，先前研究多关注自养菌、硫氧化菌、硫酸盐还原菌，然而对降解有机物、连接自养与矿化的异养菌，以及不同层分解代谢差异了解不足。因此，研究人员在扩增子测序变异体（amplicon sequencing variant, ASV）水平开展16S rRNA基因扩增子测序，并辅以宏基因组组装基因组（metagenome-assembled genome, MAG），重点解析异养菌多样性和垂直分布，推断沿氧梯度的分解代谢组织及对生物地球化学循环的贡献。研究显示Lake Suigetsu微生物群落存在清晰垂直分层，各层具不同分类组成和代谢潜力，异养菌与自养、硫氧化和硫酸盐还原过程共同构成层依赖性生物地球化学循环。

关键技术方法：2022年10月7日于Lake Suigetsu中央（35°35′N，135°53′E）采集0.5、4.0、8.9 m水样，分别代表含氧混合层、氧跃层和上部缺氧单对流层。用RINKO-Profiler和便携多参数水质仪测温度、盐度、溶解氧（dissolved oxygen, DO）和浊度。水样经3.0 μm和0.22 μm过滤后提取DNA。16S rRNA基因V4–V5区用Illumina MiSeq测序，QIIME2、DADA2构建ASV，SILVA 138 SSU分类，并计算Shannon、Pielou、Simpson均匀度和observed ASV。宏基因组用DNBSEQ-G400 2×200 bp测序，经fastp、metaSPAdes、Bowtie2、anvi’o和DAS Tool分箱，CheckM评估，dRep去冗余，GTDB-Tk/BAT分类，METABOLIC和eggNOG-mapper预测代谢。

研究结果：
理化结构：采样时DO在0–3 m为7.00–8.32 mg/L，3–5 m急降，5 m以下低于检测限；盐度0–3 m为6–8 psu，3–5 m渐增，5 m以下饱和于15 psu；浊度在3–5 m最高；温度0–3 m为21–22 °C，3–5 m最高24 °C，5–10 m降至15 °C，10 m以下稳定。据此氧跃层约在4 m，以上为含氧混合层，以下为缺氧单对流层。
水样特征：0.5 m水样DO为8.23 mg/L、盐度6.92 psu；4.0 m水样DO为0.48 mg/L、盐度10.79 psu；8.9 m水样DO低于检测限、盐度14.27 psu。
测序概览：MiSeq分别产生226,386、241,590、240,573条读数；过滤后为128,146、139,884、146,696条，获得741、613、1260个ASV；稀释曲线饱和。
α多样性模式：Shannon指数和均匀度在含氧混合层高于氧跃层和上部单对流层；ASV丰富度以上部单对流层最高，其次混合层，氧跃层最低。表明深层和氧跃层ASV多但少数类群强优势，混合层ASV少但丰度较均匀。Baatar et al.曾提出永久分层湖缺氧层通常多样性更高，本研究模式相反，研究人员认为与深层某特定类群极端优势有关。
纲水平组成：上部单对流层最丰富为Anaerolineae 22.9%，其次Desulfobacteria 20.1%、Bacteroidia 14.7%、Chlorobia 11.1%等；氧跃层Gammaproteobacteria 46.5%，Chlorobia 15.4%；混合层Bacteroidia 31.5%，Gammaproteobacteria 14.0%，Alphaproteobacteria 13.4%等。
属和种水平ASV：大于1%相对丰度的ASV在上部单对流层、氧跃层、混合层分别为11、10、20个，占各层总过滤读数61.1%、59.6%、35.4%，提示混合层不由特定丰富物种主导。
单对流层：厌氧化能有机营养和硫酸盐还原优势ASV。最丰富ASV为未分类Anaerolineaceae细菌，19.9%，可能厌氧异养，并降低群落均匀度。Desulfatiglans spp.为10.7%和5.1%，专性厌氧、降解芳香化合物，部分类群具完整硫酸盐还原基因；Desulfosarcina sp.为1.3%，可完全氧化有机电子供体至CO₂并利用硫酸盐。Chlorobium sp.和C. phaeovibrioides分别2.4%、7.5%，为绿硫菌光自养硫氧化菌。其他丰富ASV多为可能厌氧化能有机营养菌，且除C. phaeovibrioides外多为单对流层特异。
氧跃层：化能自养和硫氧化优势ASV。最丰富ASV为Thiomicrorhabdus lithotrophica，23.5%，硫氧化化能自养、专性需氧，经Calvin循环固碳，参与初级生产。C. phaeovibrioides第二丰富。Thiomicrospira sp.和Thiolapillus brandeum亦为硫氧化化能自养。其他丰富ASV包括Ectothiorhodospiraceae、CL500_29、Woesearchaeales、未知细菌和SAR11；除部分也见于其他层外，其余为氧跃层特异。
混合层：需氧化能有机营养和产氧光自养优势ASV。Synechococcus sp.相对丰度1.4%，为产氧光自养初级生产者。最丰富ASV为SAR11，5.9%。其他丰富ASV包括Fluviicola sp.、Burkholderia pseudomultivorans、CL500_29_marine_group等，多数具化能有机营养特性，需要外源碳水化合物和氧。
MAG分析：跨三层获得83个非冗余中高质量MAG，每千碱基每吉碱基读数（Reads Per Kilobase per Gigabase, RPKG）归一化丰度显示明显深度特异性。混合层以Alphaproteobacteria、Bacteroidota、Actinobacteriota为主；氧跃层以Gammaproteobacteria尤其硫氧化谱系增加；单对流层富集Anaerolineae、Desulfobacterota、Chlorobia，与16S结果一致。单对流层Anaerolineae MAG编码发酵和厌氧有机物降解；Desulfobacterota MAG具Dsr/Asr标志基因，DsrA/B-like属还原细菌型，支持硫酸盐还原；Chlorobia MAG具不产氧光自养、硫氧化和固碳基因，DsrA/B-like属氧化细菌型。氧跃层Thiomicrorhabdus等硫氧化Gammaproteobacteria MAG编码化能自养硫氧化耦合需氧呼吸及Calvin-Benson-Bassham循环固碳。混合层一MAG分类为SAR11 clade的SYDM01属，支持其可能为微咸适应生态型；氧跃层SAR11 MAG未编码硝酸盐还原或厌氧呼吸，提示其DNA可能来自表层沉降颗粒有机物。
分层水层中碳和硫循环的微生物介导：混合层有机碳来自陆地、上游湖泊输入及Synechococcus等固碳，被SAR11等需氧异养菌消耗，部分向下转移；因3 μm过滤，Microcystis、Anabaena及真核藻等较大初级生产者未检出。氧跃层有机碳部分来自混合层，Thiomicrorhabdus lithotrophica、Thiomicrospira sp.、Thiolapillus brandeum和C. phaeovibrioides固定无机碳，约48%相对丰度由初级生产者ASV占据。上部单对流层有机碳来自上方，C. phaeovibrioides为唯一丰富初级生产者，上部单对流层可能透光并足以支持不产氧光合。硫循环方面，单对流层硫酸盐被Desulfatiglans spp.和Desulfosarcina sp.等还原，产生还原硫化合物，向上扩散后由不产氧光自养和化能自养硫氧化菌氧化，再被还原，形成闭合硫循环。

讨论部分指出，扩增子分类分辨率有限，MAG不完整限制部分代谢解释，单时间点无法解析时间变异；未来需时间序列、高质量基因组和宏转录组等。研究结论部分翻译：本研究中，研究人员证明Lake Suigetsu微生物群落存在清晰垂直分层，沿氧化还原梯度各深度层具有不同分类组成和代谢潜力。16S rRNA基因分析揭示优势微生物谱系的深度依赖变化，MAG提供其代谢能力的基因组证据。重要的是，通过整合扩增子测序和MAG重建，研究人员能够将微生物群落组成与代谢潜力联系，为理解碳硫循环如何沿氧化还原梯度组织提供机制框架。该整合方法使研究人员能够将先前报道的地球化学剖面与微生物种群分布及功能潜力联系。结果表明，异养种群主导缺氧单对流层有机物降解，而化能自养硫氧化菌和光养种群在氧跃层和更深层贡献初级生产。这些发现强调分层微生物组合介导的碳矿化与硫循环之间紧密垂直耦合。尽管本研究中若干优势类群，包括Anaerolineae、Thiomicrorhabdus和SAR11相关谱系，已在先前研究中报道，但本研究首次提供基因组证据，将其分布与Lake Suigetsu深度依赖地球化学梯度中的特定代谢功能联系。总体而言，本研究证明整合分类和基因组解析方法在桥接分层水生环境微生物群落结构与生态系统过程方面的价值。未来时间序列分析对解析时间动态和评估这些分层微生物群落稳定性至关重要。