《Frontiers in Microbiology》：Butyrate-associated antiproliferative and antitumor effects of Eubacterium limosum KGMB01548 in colorectal cancer
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引言： 近期研究表明Eubacterium limosum可抑制结直肠癌（colorectal cancer, CRC），但其短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）的具体贡献及细胞作用机制尚未完全阐明。
方法：
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引言： 近期研究表明Eubacterium limosum可抑制结直肠癌（colorectal cancer, CRC），但其短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）的具体贡献及细胞作用机制尚未完全阐明。
方法： 研究人员对一株人肠道分离株E. limosum KGMB01548进行了表征，并检测了其无细胞培养上清液（cell-free culture supernatant, ElCFS）的抗肿瘤活性。
结果： ElCFS可优先抑制人HCT116和小鼠CT26结直肠癌细胞增殖，而对非恶性CCD 841 CoN结肠细胞影响甚微。该活性在热处理和酶处理后仍保持，pH依赖性液-液萃取表明一种小分子有机酸是主要活性成分。高效液相色谱（HPLC）检测显示ElCFS中丁酸浓度为13.77 mM，乙酸浓度为23.33 mM。在10% ElCFS所递送的近似浓度下，丁酸钠（sodium butyrate, NaB；1.3 mM）产生了相当的抗增殖活性，而乙酸钠则无此效果，支持丁酸是ElCFS活性的主要候选贡献成分。ElCFS与近似浓度匹配的NaB均可增加组蛋白H3乙酰化水平，与组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase, HDAC）抑制一致，并诱导细胞凋亡，表现为PARP和caspase-3的剪切以及p53磷酸化。在葡萄糖缺乏条件下，二者的抗增殖作用显著减弱。在CT26同系肿瘤模型中，瘤周给予ElCFS可减少肿瘤生长，表明E. limosum分泌的代谢产物在肠道途径之外仍保留了局部抗肿瘤活性。口服预给予活E. limosum亦可减少后续肿瘤负荷。此外，16S rRNA基因谱分析提示若干推定产短链脂肪酸菌群及PICRUSt2预测的丁酸生物合成潜力发生适度变化，而α多样性无显著改变。
讨论： 综上所述，这些发现将E. limosum KGMB01548与丁酸相关的组蛋白乙酰化、凋亡、葡萄糖敏感性抗增殖活性及肿瘤抑制联系起来，支持进一步研究该肠道共生菌及其分泌代谢产物作为基于微生物组的结直肠癌控制策略。
论文解读文章
一、研究背景与目的
结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的主要原因。尽管遗传易感性参与部分结直肠癌的发生，但大多数病例为散发性，受饮食、生活方式、炎症等非遗传因素影响。近年来，肠道菌群因其组成和功能活性在结直肠癌患者与健康个体间存在差异而受到广泛关注。肠道菌群通过宿主营养代谢、上皮屏障功能、免疫发育和定植抵抗等多种途径影响宿主健康，其中许多效应由微生物代谢产物介导。短链脂肪酸（SCFAs）是肠道菌群通过发酵膳食纤维产生的主要代谢产物，包括乙酸、丙酸和丁酸。丁酸优先被结肠细胞利用，参与上皮屏障完整性、炎症调节和结肠稳态维持。在结直肠癌细胞中，丁酸可抑制组蛋白去乙酰化酶（HDAC），增加组蛋白乙酰化，并改变调控细胞增殖、细胞周期和凋亡的转录程序。
已有研究证实Eubacterium limosum可抑制结直肠癌，但多种生物活性代谢物共存于无细胞培养上清液中，丁酸在上清液浓度下对抗增殖活性的具体贡献程度仍不明确。此外，上清液在特定代谢条件下是否重现丁酸相关组蛋白乙酰化，以及其分泌代谢物经局部给药而非胃肠道途径时是否保留肿瘤抑制活性，这些问题均未得到解答。本研究采用独立的人源菌株E. limosum KGMB01548，旨在从微生物、生化、细胞和体内水平系统解析其抗结直肠癌活性的分子机制。
二、研究内容与主要发现
研究人员从健康韩国人粪便中分离出E. limosum KGMB01548，制备其无细胞培养上清液（ElCFS），并通过多维度实验体系评估其抗肿瘤活性。研究首先证实ElCFS可优先抑制人HCT116和小鼠CT26结直肠癌细胞增殖，而对非恶性CCD 841 CoN结肠细胞影响甚微。随后通过热处理、酶消化、溶剂分配等理化表征，结合高效液相色谱（HPLC）定量分析、基因组学分析以及丁酸钠（NaB）浓度匹配对比，鉴定出丁酸为ElCFS抗增殖活性的主要候选贡献因子。进一步研究显示，ElCFS与近似浓度匹配的NaB均能增加组蛋白H3乙酰化、诱导细胞凋亡并增强p53磷酸化，且其抗增殖效应在葡萄糖缺乏条件下显著减弱。在CT26同系小鼠肿瘤模型中，瘤周注射ElCFS和口服活菌均显著降低肿瘤负荷，提示该菌株及其代谢产物在体内具有抗肿瘤潜力。此外，16S rRNA基因测序分析表明，口服E. limosum KGMB01548后肠道微生物群落发生适度变化，部分产短链脂肪酸菌群及丁酸合成相关预测功能丰度有所升高，但整体α多样性无明显改变。
三、关键技术方法
本研究采用了多项核心技术手段。细胞增殖评估采用MTT比色法和结晶紫染色结合台盼蓝排斥计数法；活性成分鉴定采用热稳定性、酶敏感性、pH依赖性液-液萃取及HPLC定量分析；细胞凋亡和细胞周期分析采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术和PI单染DNA含量分析；蛋白表达水平采用Western blot检测组蛋白H3乙酰化、PARP、caspase-3剪切及p53磷酸化；基因表达分析采用逆转录-定量PCR（RT-qPCR）检测CASP8和CASP9 mRNA水平；基因组学分析采用全基因组测序（Illumina NovaSeq平台）结合SPAdes组装及多数据库功能注释；动物实验采用CT26同系BALB/c小鼠皮下移植瘤模型，分别进行瘤周ElCFS注射和口服活菌预干预；肠道菌群分析采用16S rRNA基因V3-V4区扩增子测序（Illumina MiSeq平台）结合DADA2分析流程和PICRUSt2功能预测；血清丁酸浓度采用ELISA法检测；肿瘤免疫浸润采用免疫组化（IHC）检测CD3阳性T细胞。
四、研究结果
4.1 ElCFS优先抑制结直肠癌细胞增殖。 通过结晶紫染色和MTT实验证实，10%（v/v）ElCFS处理72小时可显著减少HCT116和CT26细胞增殖，且呈浓度依赖性，但对非恶性CCD 841 CoN结肠细胞无明显抑制作用。
4.2 ElCFS活性与耐热、水溶性组分相关。 热稳定性实验表明，100°C加热10分钟不改变ElCFS的抗增殖活性；酶处理（淀粉酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K、脂肪酶）后活性仍保持；pH 6.8时乙酸乙酯萃取活性主要存在于水相，表明活性成分为耐热、耐酶的小分子极性代谢物。
4.3 丁酸是ElCFS抗增殖活性的主要候选因子。 HPLC检测显示ElCFS中丁酸浓度为13.77 mM，乙酸浓度为23.33 mM。pH 2.5时丁酸从水相转移至有机相，伴随活性从水相转移至有机相。NaB在0.5-2 mM范围内呈浓度依赖性抑制HCT116增殖，而乙酸钠无此效果。10% ElCFS递送的丁酸浓度约为1.38 mM，与1.3 mM NaB产生相当的抗增殖活性。二者均增加组蛋白H3乙酰化，且其抗增殖作用在葡萄糖缺乏条件下显著减弱。全基因组测序证实KGMB01548含有完整的乙酰辅酶A-丁酸合成途径基因，包括硫解酶、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶/电子转移黄素蛋白和丁酰辅酶A:乙酸辅酶A转移酶。
4.4 ElCFS与浓度匹配的丁酸诱导细胞凋亡。 流式细胞术显示ElCFS和NaB处理组Annexin V阳性细胞比例显著增加（ElCFS组总凋亡率17.73%，NaB组17.17%，RCM组1.76%）。Western blot检测到PARP和caspase-3剪切以及p53磷酸化水平增加。RT-qPCR显示CASP9表达上调而CASP8无显著变化，提示主要激活内源性凋亡途径。细胞周期分析显示ElCFS引起G0/G1期比例增加和S期比例减少，但变化幅度有限，远小于5 mM NaB引起的G2/M期阻滞。
4.5 ElCFS瘤周注射和口服活菌预干预降低肿瘤负荷。 在CT26同系小鼠模型中，瘤周注射ElCFS使最终肿瘤体积降低52.62%，肿瘤重量降低37.83%；口服活E. limosum预干预使最终肿瘤体积降低44.83%，肿瘤重量降低32.53%。肿瘤组织Western blot检测到cleaved-caspase-3信号增强，免疫组化显示口服菌组肿瘤中CD3阳性细胞数量显著增加，提示T细胞浸润增多。
4.6 口服E. limosum引起适度肠道菌群及预测功能改变。 16S rRNA基因测序显示，口服E. limosum后α多样性（ASV数、Chao1指数、Shannon指数）无显著改变，但Bacillota/Bacteroidota比值降低。多个产短链脂肪酸相关菌群相对丰度升高，Eubacterium属相对丰度适度增加。PICRUSt2功能预测显示丁酸相关代谢途径的预测丰度升高。
五、讨论与结论
本研究将E. limosum KGMB01548的分泌代谢物与丁酸介导的组蛋白乙酰化、凋亡、葡萄糖敏感性抗增殖活性及肿瘤抑制效应联系起来。与Lu等（2025）报道的多代谢物和生态系统级机制不同，本研究聚焦于ElCFS中丁酸实际浓度下的功能贡献，通过浓度匹配对照实验和理化特征分析提供了更直接的因果证据。研究证实ElCFS的分泌代谢产物在非胃肠道途径（瘤周注射）下仍保留局部抗肿瘤活性，提示其活性不依赖于肠道菌群重塑。口服活菌预干预实验表明该菌株可作为预防性干预手段。肠道菌群分析显示其作用模式为适度调节而非广泛重塑。
研究结论指出，E. limosum KGMB01548通过分泌丁酸发挥抗结直肠癌活性，丁酸通过抑制HDAC增加组蛋白乙酰化、诱导凋亡并发挥GC依赖性抗增殖作用，该菌株及其分泌代谢产物有望成为基于微生物组的结直肠癌控制策略。然而，研究也承认ElCFS成分复杂，不能完全排除其他代谢物单独或协同丁酸发挥作用的可能性，未来需要进一步验证丁酸的必要性和定量贡献。
