西班牙西北部农业土壤作为产毒镰刀菌潜在储库的研究

《Frontiers in Fungal Biology》：Agricultural soils as a potential reservoir of mycotoxigenic Fusarium spp. in northwest Spain

摘要 镰刀菌属（Fusarium）物种广泛分布于全球农业生态系统，是最具经济危害性的植物病原真菌之一。它们能够定殖于多种农业食品作物，引发植物病害并在可食用植物组织中积累真菌毒素。镰刀菌属物种产生多种次生代谢产物，对人类和动物健康构成毒理学风险。研究人员从伊比利亚半岛西北部农业土壤中分离了共计119株镰刀菌菌株，在分子水平上进行了物种鉴定，并利用液相色谱-高分辨率质谱法（LC-HRMS）评估了它们在体外条件下产生17种真菌毒素的能力。研究中观察到高度的镰刀菌生物多样性，共检测到8个物种复合体中的15个镰刀菌物种，其中一些物种此前在西班牙土壤中未被广泛描述，包括 Fusarium algeriense、Fusarium brachygibbosum、Fusarium clavum 和 Fusarium flagelliforme。每株镰刀菌菌株均表现出特定的真菌毒素图谱，且浓度各异。白僵菌素（beauvericin）和恩镰孢菌素（enniatins）最为普遍，含量极高，并且对于多个物种而言，其产生此前未见报道。与先前报告相比，单端孢霉烯族毒素（trichothecenes）和伏马菌素（fumonisins）的检出频率较低。多真菌毒素图谱主要由物种同一性（唯一显著因素）决定，而非土壤环境特征。这些发现突显了土壤作为植物病原性和产毒性镰刀菌属物种储库的作用，有助于表征其产毒图谱，并强调了对新兴真菌毒素进行调查的必要性。

一、研究背景与科学问题

镰刀菌属（Fusarium）是一类在全球农业生态系统中普遍存在的丝状真菌，属于子囊菌门（Ascomycota）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）、肉座菌目（Hypocreales）。该属物种是破坏性最强的植物病原真菌之一，宿主范围广泛，能引起多种影响不同植物器官和发育阶段的疾病，尤其对谷类作物危害严重。除了造成植物病害，镰刀菌还能产生大量次生代谢产物，包括聚酮化合物（如镰刀菌素、伏马菌素和镰刀菌酸）、萜类化合物（如T-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和其他单端孢霉烯族毒素）以及非核糖体肽（如恩镰孢菌素和白僵菌素）。这些代谢物在植物中诱发感染症状，并对人类和动物健康构成重大风险，因此被视为毒素。其中一些真菌毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、T-2毒素、HT-2毒素、玉米赤霉烯酮（ZEA）和伏马菌素（FBs），因其重要性而受到严格监管。然而，另一些被称为“新兴真菌毒素”的代谢物，如串珠镰刀菌素、恩镰孢菌素（ENNs）、白僵菌素（BEA）和镰刀菌素，由于对其毒性和发生情况的数据有限，尚未被常规监测或纳入法规限制，但其对动物健康和环境的潜在影响日益受到关注。

尽管已知镰刀菌能在土壤和植物残体中长期存活，农业土壤中存在高度多样性，且土壤非生物因子（如pH值、有机质含量、质地）会影响其分布和致病活性，但这些环境变量的影响高度依赖于物种本身的遗传特征。目前，针对农业土壤中镰刀菌物种的真实多样性和产毒潜力的系统性研究仍然不足，特别是将菌株层面的物种鉴定与全面的多真菌毒素产毒谱分析相结合的研究较为缺乏。因此，本研究旨在通过对西班牙西北部多种农田土壤中分离的镰刀菌菌株进行系统的分子鉴定和体外产毒能力评估，揭示土壤作为植物病原体和真菌毒素储库的潜在风险，并阐明物种同一性与环境因素在塑造产毒谱中的相对作用。

二、主要技术方法

研究人员从西班牙西北部莱昂、萨莫拉、巴利亚多利德、布尔戈斯和阿斯图里亚斯等省份的66份农田土壤样本中分离真菌。这些样本来自葡萄园、谷物田、豆科作物地、园艺作物地、休耕地和啤酒花田。通过形态学初步筛选后，利用内部转录间隔区（ITS）测序确认菌株属于镰刀菌属，再通过翻译延伸因子1α（tef1）基因测序进行精确的物种水平分子鉴定，并结合最大似然法构建系统发育树。随后，将所有菌株在蒸谷米培养基上进行体外培养，采用乙腈/水/乙酸混合液提取真菌毒素，并运用液相色谱-高分辨率质谱法（LC-HRMS）定量分析17种目标真菌毒素，包括白僵菌素（BEA）、四种恩镰孢菌素（ENN A, A₁, B, B₁）、镰刀菌酸、镰刀菌素C、伏马菌素（FB₁, FB₂, FB₃）、单端孢霉烯族毒素（NIV, DON, 15-ADON, 3-ADON, NEO, DAS, HT-2, T-2）和玉米赤霉烯酮（ZEA）。最后，应用主坐标分析（PCoA）、k-means聚类、置换多元方差分析（PERMANOVA）和基于变换的冗余分析（tb-RDA）等多种统计方法，分析产毒谱与物种同一性、物种复合体（SC）以及土壤理化性质（pH、有机质含量、碳氮比）和作物类型之间的关系。

三、研究结果

3.1 土壤样本中镰刀菌物种的发生与真菌毒素检测

除了三个葡萄园土壤样本外，其余所有土壤样本均被镰刀菌污染。研究人员最终获得119株镰刀菌菌株，分子鉴定显示存在高度的物种多样性，共鉴定出属于8个物种复合体（SC）的15个物种。优势物种复合体为尖孢镰刀菌复合体（FOSC，占46.6%）、茄病镰刀菌复合体（FSSC，占25.2%）和肉色-木贼镰刀菌复合体（FIESC，占11.8%）。具体物种方面，Fusarium oxysporum（35%）最为常见，其次是Fusarium solani（24%）和Fusarium nirenbergiae（11%）。研究还发现了在西班牙土壤中鲜有报道的物种，如Fusarium algeriense、Fusarium brachygibbosum、Fusarium clavum和Fusarium flagelliforme。

3.2 真菌毒素的产生

在所有115株有效测量的菌株中，白僵菌素（BEA）是最常检出的真菌毒素，检出率高达91%，其次为恩镰孢菌素（ENNs），检出率为34%-45%。镰刀菌酸和镰刀菌素C的检出率分别为28%和21%。在浓度上，ENNs和BEA的平均产量最高。相反，传统的单端孢霉烯族毒素（如DON、NEO、DAS、HT-2）和伏马菌素（FBs）的检出频率较低（均低于10%），而雪腐镰刀菌烯醇（NIV）则完全未检出。乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（ADON）和T-2毒素仅由对照菌株产生。

3.3 真菌毒素相关性分析

Spearman秩相关分析揭示了多种毒素之间的共现模式。所有ENNs之间呈强正相关，并与BEA也呈正相关。伏马菌素（FB₁和FB₂）之间存在强正相关。A型单端孢霉烯族毒素（NEO、DAS、HT-2、T-2）之间以及B型单端孢霉烯族毒素（DON、ADON）之间均呈正相关。值得注意的是，BEA与ZEA、镰刀菌酸以及镰刀菌素C之间均呈负相关，表明这些毒素在产生上可能存在相互排斥关系。

3.4 真菌毒素产生谱由内在因素驱动

主坐标分析（PCoA）显示，菌株根据其产毒谱在排序空间中呈现一定的分布趋势，其中BEA和ENNs是主要的变异贡献者。k-means聚类分析将菌株稳定地分为两个簇，这两个簇的区别在于产毒数量和质量，而非总产量。簇1的菌株倾向于只产生一种毒素（主要是高浓度的BEA），而簇2的菌株则产生更多种类的毒素（包括多种ENNs、BEA和镰刀菌酸）。物种同一性和物种复合体（SC）与簇的归属显著相关，而土壤参数（pH、有机质、C/N比）和作物类型则无显著关联。进一步的置换多元方差分析（PERMANOVA）证实，物种复合体（SC）对整体产毒谱有极显著的影响，解释了约29%的变异。在对SC进行条件约束后，基于变换的冗余分析（tb-RDA）表明，所测试的土壤环境和作物变量对产毒谱的解释度极低（调整后R2≈0.006），且不显著。单个毒素的分析也显示，所有毒素在不同SC间的产量均有显著差异，且效应量很大。

四、讨论与结论

本研究表明，西班牙西北部农业土壤中蕴藏着高度多样化的镰刀菌种群，其中包括一些此前在该地区未曾报道的物种，如F. algeriense和F. brachygibbosum，后者已被欧盟列为潜在的危险病原体。研究首次系统地描述了这些土壤源镰刀菌菌株的多真菌毒素产生谱，发现白僵菌素（BEA）和恩镰孢菌素（ENNs）等“新兴真菌毒素”的检出率和产量远高于传统受监管的毒素（如单端孢霉烯族毒素和伏马菌素），这提示在食品安全风险评估中应给予这些新兴毒素更多关注。此外，研究还发现了一些物种产生了此前未被报道过的毒素，例如多个物种产生了ENNs，以及一株F. solani产生了伏马菌素，这可能暗示着水平基因转移事件的存在。

最关键的研究结论是：真菌毒素的产生谱主要由镰刀菌的物种同一性（即遗传因素）决定，而非采样点的土壤理化性质（如pH、有机质含量）或作物类型。这意味着，即使在不同环境条件下，特定镰刀菌物种的产毒潜力是其固有的、保守的特征。这一发现强调了在预测和管理田间真菌毒素风险时，精准识别土壤中存在的镰刀菌物种至关重要。尽管物种复合体解释了约30%的产毒谱变异，但仍存在65%的残余变异，这归因于菌株水平的巨大个体差异以及其他未能测量的环境或生态因素。总之，这项工作清晰地阐明了农业土壤是一个重要的植物病原性和产毒性镰刀菌的储库，其携带的产毒潜力不容忽视，特别是那些新兴的真菌毒素，为未来的粮食安全和公共卫生风险评估提供了关键的科学依据。