工程改造的侵袭性乳乳球菌作为口服疫苗递送平台，与区室化免疫调节相关，并增强了对婴儿利什曼原虫感染的控制

《Vaccine》：Engineered invasive Lactococcus lactis as an oral vaccine delivery platform is associated with compartmentalized immune modulation and enhances control of Leishmania infantum infection

由婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum）引起的内脏利什曼病（VL）仍是疫苗开发的主要挑战，这归因于寄生虫的细胞内定位以及对有效抗原递送和细胞免疫反应的需求。基因工程改造的乳酸菌已成为黏膜疫苗接种的有前景平台，因为它们具有遗传可操作性以及与宿主免疫系统相互作用的能力。在本研究中，我们评估了一种表达纤连蛋白结合蛋白A（FnBPA）的工程化侵袭性乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）株，该菌株携带嵌合TryPan抗原编码质粒，作为口服疫苗递送平台，并将其免疫学和寄生虫学结果与皮下免疫接种重组TryPan配单磷酸脂质A（MPLA）进行了比较。口服递送侵袭性乳酸乳球菌与肠道趋化因子表达、Th1/Th17相关细胞因子和炎症细胞标志物的变化有关，同时调节全身免疫参数。在婴儿利什曼原虫攻击后，口服递送携带TryPan构象的乳酸乳球菌导致肝脏寄生虫负荷与相应感染对照组相比降低了约99%。值得注意的是，单独给予乳酸乳球菌也降低了肝脏寄生虫负荷，表明细菌载体对所观察到的寄生虫学结果有所贡献，而与TryPan递送相关的更大程度降低则提示了与疫苗构象相关的额外效应。皮下免疫接种重组TryPan配单磷酸脂质A诱导了更广泛的全身细胞因子反应，并将肝脏寄生虫负荷降低了约90%。多变量分析根据疫苗接种策略确定了黏膜、全身和肝脏参数之间关联的不同模式。总之，这些发现支持了侵袭性乳酸乳球菌作为口服疫苗递送平台的潜力，并突出了细菌载体相关免疫调节和抗原递送对所观察到的肝脏婴儿利什曼原虫负荷控制的贡献。婴儿利什曼原虫是内脏利什曼病的病原体，由于其细胞内生活方式以及在宿主巨噬细胞中的持续存在，仍然是疫苗开发的主要挑战[1]。有效的免疫控制主要依赖细胞机制，特别是涉及IFN-γ和IL-12的Th1相关反应，这些反应有助于巨噬细胞激活和寄生虫控制[1], [2]。疫苗有效性还取决于递送平台有效呈递抗原并激活相关免疫区室的能力。传统注射疫苗主要诱导全身反应，而黏膜疫苗还可额外激活抗原暴露部位的局部免疫网络并影响全身免疫[3], [4]。口服给药后，疫苗成分与肠上皮细胞和黏膜免疫细胞相互作用，其中抗原摄取和固有激活塑造了后续的适应性反应[4], [5], [6]。然而，口服疫苗仍然具有挑战性，因为抗原必须经受胃肠道环境的考验，并以适当的形式到达免疫应答位点。微生物载体提供了一种替代方法，通过将抗原递送与黏膜免疫的内在相互作用相结合。在这些平台中，基因工程改造的乳酸菌，特别是乳酸乳球菌，因其遗传可操作性、既定的生物技术应用以及与上皮细胞和免疫细胞相互作用的能力，已成为有吸引力的候选者。工程化乳酸乳球菌株已被研究用于递送治疗性蛋白和DNA构象，并能调节黏膜免疫反应[7], [8], [9]。纤连蛋白结合蛋白A的表达赋予乳酸乳球菌侵袭性表型，促进其与哺乳动物细胞的相互作用，并支持其作为基于DNA方法的载体[10], [11]。然而，将工程化乳酸乳球菌平台应用于全身性原虫感染，包括内脏利什曼病，仍相对未被充分探索[12], [13]。在利什曼病疫苗候选抗原中，TryPan嵌合体结合了多种锥虫（包括克氏锥虫和利什曼原虫）保守的T细胞表位，据报告可刺激与控制细胞内婴儿利什曼原虫感染相关的CD8? T细胞反应[14]。将其纳入微生物递送平台提供了一个机会，用于调查口服递送工程化乳酸乳球菌是否能将抗原递送与细菌免疫调节特性相结合。在本研究中，我们评估了一种携带TryPan抗原编码DNA构象的工程化侵袭性乳酸乳球菌FnBPA?株，作为针对实验性婴儿利什曼原虫感染的口服疫苗平台。攻击后评估了肠道、全身和肝脏免疫参数以及肝脏寄生虫负荷。作为比较性注射参考，纳入了使用配单磷酸脂质A的重组TryPan的皮下策略。通过整合免疫学、组织病理学、酶学、转录组和寄生虫学参数，我们表征了与口服疫苗相关的反应及其与肝脏婴儿利什曼原虫控制的关系。重组质粒pExu-LALU和pET-28a-TEV由GenScript（美国）商业合成并进行了序列验证。TryPan被克隆到pExu-LALU的BamHI和XhoI之间，以及pET-28a-TEV的NdeI和XhoI之间。pExu-LALU骨架由我们团队内部设计[15]，随后由GenScript（美国）合成和序列验证。pExu-LALU:TryPan被导入电感受态的乳酸乳球菌FnBPA?细胞（最初由[16]描述）（0.2厘米比色皿，2.4 kV），并且...为了在功能测试前确认基于质粒的疫苗平台构建成功，我们通过PCR验证了重组乳酸乳球菌和大肠杆菌构象，并通过SDS-PAGE和Western blot确认了重组TryPan蛋白身份。PCR通过扩增预期的220 bp β-肌动蛋白启动子片段，在乳酸乳球菌中确认了pExu-LALU:TryPan构象（图1A），而菌落PCR通过约...确认了重组大肠杆菌SHuffle pET-28a-TEV菌株。有效的针对细胞内病原体的疫苗需要适当的抗原和能够引导相关免疫反应的递送系统。在本研究中，口服给予携带TryPan DNA构象的侵袭性乳酸乳球菌FnBPA?与广泛的肠道和全身免疫调节以及挑战后35天肝脏婴儿利什曼原虫负荷降低约99%相关。重要的是，不含TryPan的细菌载体也降低了肝脏负荷，通过...在本研究中，口服给予携带TryPan DNA构象的工程化侵袭性乳酸乳球菌FnBPA?与广泛的肠道和全身免疫调节以及肝脏婴儿利什曼原虫负荷显著降低相关，在挑战后35天达到约99%。重要的是，细菌载体单独使用也与肝脏寄生虫负荷显著降低相关，而Llac+ASC组显示的效果更为有限。这些发现...在工作准备过程中，作者使用了Gemini、Canva和BioRender来创建图形摘要。在使用这些工具后，作者仔细监督、审查和编辑了生成的内容（根据需要），并对已发表文章的内容承担全部责任。José Bryan Rihs：写作–审查与编辑，写作–初稿，可视化，验证，方法学，调查，数据管理，概念化。Isabela de Brito Duval：方法学，调查，数据管理。Chiara Cássia Oliveira Amorim：方法学，调查。Jordania Costa Pinto：方法学，调查。Ana Laura Grossi de Oliveira：写作–审查与编辑，写作–初稿，可视化，方法学，调查。Gabriela Gomes Monteiro Lemos：...不适用。本研究按照以下动物福利和/或报告指南进行：巴西国家动物实验控制委员会指南。本研究经UFMG动物使用伦理委员会批准（批准号336/2023）。本工作由CAPES通过授予JBR、TMC、IBD、MEC、JCP、MS的博士奖学金以及授予ISO和MLTSB的硕士奖学金支持，以及授予JLNS的博士后fellowship；由FAPEMIG通过一般研究资金和授予ALGO和CCOA的博士后fellowship，以及授予ARAP的硕士奖学金支持；以及由CNPq提供额外研究支持。作者声明，他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文报告的工作。作者感谢巴西米纳斯吉拉斯州研究基金会（FAPEMIG）（项目号：APQ4035/2017；APQ5079/2023）；米纳斯吉拉斯免疫生物制剂网络（RED-00067-23），米纳斯吉拉斯传染病诊断网络（RED-00196-23），巴西国家科学和技术发展委员会（CNPq）（403278/2023-6；442994/2019-2），以及黏膜和皮肤慢性与传染病国家研究中心（INCT Mucosas e Pele, CNPq 408484/2024-1）的...José Bryan Rihs|Isabela de Brito Duval|Chiara Cássia Oliveira Amorim|Jordania Costa Pinto|Ana Laura Grossi de Oliveira|Gabriela Gomes Monteiro Lemos|Tatyane Martins Cirilo|Marcelo Eduardo Cardozo|Izabela da Silva Oliveira|Ana Rafaela Antunes Porto|Luisa Vitor Braga do Amaral|Getúlio Campos Mota|Andressa de Oliveira-Silva|Sara Braga Mendanha|Ana Clara Santana de Sousa|Maria Luiza Tanos dos Santos Brant|Karla Karoline Santos Ramos|Jorge Lucas Nascimento Souza|Fernanda Lima Alvarenga Barroso|Rhayane Cristina Viegas Santos|Ricardo Toshio Fujiwara