突尼斯市售胰岛素-锌药品的HPLC-UV与AAS双分析法开发、验证及常规稳定性研究

《Biomedical Chromatography》：Development and Validation of Two Analytical Methods Using High-Performance Liquid Chromatography and Atomic Absorption Spectroscopy for the Analysis of Tunisian Marketed Pharmaceutical Product-Based Insulin and Zinc: Application in Routine Stability Study

鉴于糖尿病患者对胰岛素的广泛依赖，确保其稳定性不仅对保持治疗效果至关重要，而且对保障患者健康与安全必不可少。此外，胰岛素储存实践常被误解，可能损害药物效力。而且，突尼斯提供的不同胰岛素产品的有效期存在差异。因此，研究人员采用了两种分析方法，分别利用高效液相色谱-紫外检测器（HPLC-UV）分析胰岛素，利用原子吸收光谱法（AAS）分析突尼斯市售基于胰岛素药品中的锌。随后评估了这些产品的稳定性。研究表明，在中性pH下暴露于日光、25°C至少30天时，胰岛素稳定性良好，而仅在pH 2的稀释溶液中观察到不稳定。研究人员的工作强调有必要对胰岛素稳定性进行更全面评估，尤其是在无法持续冷藏的条件下。此类评估对于制定实用储存指南并确保资源有限环境中的治疗效果至关重要。

研究背景与目的：胰岛素是由Langerhans beta细胞合成的多肽激素，在血糖稳态及脂质、蛋白代谢中起关键作用，用于1型糖尿病及部分2型糖尿病。胰岛素常与锌结合，六个胰岛素分子与两个锌原子形成六聚体，是其稳定储存形式，需转为单体才有生物活性。市售人胰岛素产品包括insulin soluble、insulin isophane和insulin biphasic isophane，均含锌，欧洲药典要求总锌不超过40.0 μg/mL。胰岛素稳定性对疗效和患者安全至关重要，但配方、生产和储存条件可影响稳定性；储存实践常被误解，开瓶后货架期信息不一致，部分厂家未提供足够数据评估热带炎热、乡村、冲突和冷藏受限条件下的储存。因此，研究人员开发并验证高效液相色谱-紫外检测器（HPLC-UV）和原子吸收光谱法（AAS）分别测定胰岛素和锌，并应用于突尼斯市售胰岛素产品的常规稳定性研究。

研究开展、结论与意义：研究人员开发了HPLC-UV法同时分离分析胰岛素、辅料和主要降解产物A21-desamido-insulin（A21脱酰胺胰岛素），并开发AAS法测定锌。两种方法经验证后用于六种突尼斯市售人胰岛素产品（来自A、B两个厂家，包括insulin soluble、insulin isophane和insulin biphasic isophane）的质量控制和应激稳定性评估。结论为：在中性pH（7.00–7.80）、25°C日光暴露、原包装中至少30天，胰岛素稳定；但在稀释至1 mg/mL、HCl 0.01 M、pH 2.38–2.47条件下不稳定，出现A21-desamido-insulin。锌在所有产品中低于40 μg/mL，并在25°C日光暴露30天后保持稳定。该研究为资源有限或无持续冷藏条件下胰岛素储存指南提供了分析学和稳定性依据，并提示稀释酸性溶液应新鲜制备。

主要关键方法：以HPLC-UV（Agilent 1260，ODS Hypersil柱，214 nm，乙腈/甲醇/0.2 M pH 3磷酸盐缓冲液）进行等度与梯度筛选，并按ICH Q2(R2)验证；以火焰AAS（Perkin Elmer PinAAcle 500，213.9 nm）测锌并验证。样本为当地药房购买的两个厂家A、B的insulin soluble、insulin isophane、insulin biphasic isophane人胰岛素注射液/混悬液；标准胰岛素来自当地药企，标准锌来自PERKIN ELMER。稳定性按ICH Q5C，25°C日光暴露，开瓶后及10、20、30天分析；稀释pH 2另测；锌开瓶与30天后比较。

研究结果：
3.1 胰岛素测定法
3.1.1 胰岛素分析方法开发：初步条件导致胰岛素峰宽、拖尾，保留时间21.4 min，且与A21-desamido-insulin未分离。优化乙腈比例至28%、磷酸盐缓冲液0.2 M后，获得胰岛素与A21-desamido-insulin分离度1.74、A21-desamido-insulin与苯酚分离度2.25，对称因子1.7–1.8。梯度法使二者分别在5.6和6.1 min洗脱，分离度和峰形更好；验证采用等度法。
3.1.2 HPLC法验证：
3.1.2.1 特异性：胰岛素、A21-desamido-insulin和辅料峰无干扰，甘油在214 nm不吸收，匹配因子1000。
3.1.2.2 线性：0.6–1.4 mg/mL，D1和D2的R²均为0.998，截距和斜率无显著差异，统计检验通过。
3.1.2.3 精密度：日内和日间CV分别为0.61%和0.63%，Cochran检验通过。
3.1.2.4 准确度：平均回收率99.86%，95%置信区间98.68%–101.04%，检验通过。
3.1.2.5 稳健性：Box–Behnken DoE（试验设计）考察乙腈%、缓冲液浓度和流速，所有实验中胰岛素峰对称因子及R₁、R₂均可接受。
3.1.2.6 LOD和LOQ：分别为0.006和0.020 mg/mL。
3.1.3 产品控制和稳定性研究：六种产品初始含量在90%–110%范围内，未检出A21-desamido-insulin。中性pH日光25°C 30天后仍符合，未检出降解产物。稀释pH 2条件下，第10天起检出A21-desamido-insulin，30天后所有产品均不符合标准：五种胰岛素含量低于90%，一种含量高于90%但A21-desamido-insulin达12.31%。
3.2 锌测定法
3.2.1 方法验证：
3.2.1.1 特异性：1 μg/mL锌溶液加基质与不加基质吸光度无显著差异，Mann–Whitney p=0.296。
3.2.1.2 线性：0.2–1.6 μg/mL，D3和D4的R²为0.995和0.996，截距和斜率无显著差异，统计检验通过。
3.2.1.3 精密度：日内和日间CV为0.05%和0.16%，Cochran检验通过。
3.2.1.4 准确度：平均回收率101.33%，95%置信区间98.04%–104.62%，检验通过。
3.2.1.5 LOD和LOQ：分别为0.005和0.015 μg/mL。
3.2.2 胰岛素产品中锌控制和稳定性研究：所有突尼斯市售人胰岛素产品锌含量均低于40 μg/mL，符合欧洲药典和USP。开瓶时与25°C日光30天后锌含量无显著差异，Mann–Whitney p=0.873，说明锌稳定。

讨论总结：讨论认为，HPLC-UV等度法简单、成本低、适合常规分析，故用于验证和稳定性研究；方法快速（≤10 min），分离度和峰形满意，较Najjar et al.、Moslemi et al.等具有更短分析时间。A21-desamido-insulin通过0.2 mg/mL标准胰岛素在HCl 0.01 M中37°C孵育28天制备，降解约90%。梯度法峰形更优，但等度法更易实施。与Kaufmann and Boulle法相比，后者虽4 min内完成但需二元泵且不能分离A21-desamido-insulin。HPLC法特异性、精密度和准确度符合要求；LOD/LOQ略高但适合常规分析。稳定性方面，中性pH、原包装、25°C日光30天稳定，与Kaufmann等、Moses等、Baechler等报道的高温或应激条件下稳定性相符；稀释酸性pH 2不稳定，可能与pH有关，且protamine–zinc–insulin复合物产品降解较少。AAS法简单、快速、精密度高、LOD/LOQ低，但只能测一种元素；HPLC-UV可单次运行分析多组分并检测降解产物，但耗时、耗能、耗溶剂且需平衡和冲洗。两法各有优劣，联合使用可满足法规质量控制要求。

结论翻译：研究人员在本研究中成功开发了分别基于HPLC-UV和AAS的两种分析方法，用于胰岛素和锌的测定。根据ICH要求，两种方法均被判断为简单、快速、选择性好、精密度和准确度良好，能以直接及时的方式提供精确测量。因此，它们可用于基于胰岛素和锌的药品常规分析，正如研究人员的研究所证实。研究人员在控制一些突尼斯市售基于胰岛素药品时的应激降解稳定性研究结果显示，胰岛素在原包装、中性pH、暴露于日光25°C长达30天时稳定性良好。然而，在稀释酸性介质（HCl 0.01 M，pH 2）中，降解风险更高。因此，每次通过HPLC分析控制胰岛素时应新鲜制备溶液。总之，研究人员的研究使建立基于胰岛素药品的一些稳定性条件，为其他研究完成25°C日光暴露下更长时间的长期稳定性研究铺路。此外，有必要开展其他研究，评估在热热带地区温度超过37°C时冷链未遵守情况下胰岛素产品的稳定性，以定义实际胰岛素稳定性条件，并最终改变储存条件建议，以帮助经济匮乏或居住在偏远地区的患者。