多发性骨髓瘤合成细胞模拟物作为流式细胞术检测质控品的评估

《Cytometry Part B: Clinical Cytometry》：Evaluation of a multiple myeloma synthetic cell mimic as an assay control for flow cytometry

临床流式细胞术检测的可靠性依赖于能够准确反映代表性样本的稳健质控品的可获得性。广泛使用的传统质控品（如细胞系）往往无法复制代表性原代样本的表型及生物物理特性，导致设门（gating）变异，且由于某些标志物可能不表达，检测性能的置信度受限。为应对这些局限，研究人员利用Slingshot Biosciences公司的TruCytes?技术开发了一种定制化的多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）合成细胞模拟物（cell mimic）。目前，MM1.S细胞系可作为流式细胞术panel中的检测质控品，用于评估骨髓穿刺样本中浆细胞（plasma cells, PCs）和B细胞上的关键标志物——B细胞成熟抗原（B cell maturation antigen, BCMA）和G蛋白偶联受体C类5组成员D（G protein-coupled receptor, class C, group 5, member D, GPRC5D），以支持MM临床试验。尽管MM1.S对关键标志物BCMA和GPRC5D呈强表达，但其缺乏PC和B细胞鉴定所需的CD45和CD19。研究人员旨在工程化一种MM细胞模拟物，以模拟新鲜MM骨髓穿刺样本检测中的散射特性和抗原密度。研究人员对具有代表性的MM骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cells, BMMCs）进行审阅，以确定PCs和B细胞上CD45、CD19、CD38、CD138、BCMA、GPRC5D、CD56和PD-L1的散射特性及代表性中位荧光强度（median fluorescence intensity, MFI）。研究人员基于MM BMMC样本，工程化了包含一个代表PCs的群体和另一个代表B细胞的群体的MM细胞模拟物。该MM细胞模拟物克服了传统MM细胞系（如MM1.S）中CD45和CD19表达缺失以及散射和MFI谱图差异的问题。验证（qualification）研究证明了批内和批间精密度（%CV ≤20%）、稳健的仪器间重现性、重组后在4°C下长达7天的稳定性，以及?20°C闭瓶保存长达13个月的稳定性。总之，这些结果确立了MM模拟物作为MM1.S的改进型替代检测质控品，有助于临床流式细胞术中的纵向检测性能监测和持续质量保证。

论文解读：多发性骨髓瘤合成细胞模拟物作为流式细胞术检测质控品的评估

一、研究背景与意义

可靠的流式细胞术检测依赖于高质量的检测质控品，以识别技术流程中的偏差并确保检测性能的一致性。质控品与临床样本之间的不匹配可能损害检测结果的解读，因此质控品的设计至关重要。传统的检测质控材料，如细胞系和健康原代供体细胞，往往无法重现疾病患者样本的表型特性。细胞系可能缺乏临床相关标志物的表达，或表现出异常的散射特征，导致需要与待测样本设门策略相互独立的设门方案。这些局限性凸显了对能更贴近临床样本行为、支持检测结果可靠解读的标准化质控品的需求。

在多发性骨髓瘤（MM）中，浆细胞（PCs）和B细胞上的B细胞成熟抗原（BCMA）和G蛋白偶联受体C类5组成员D（GPRC5D）已成为CAR T细胞治疗的靶点，双靶点策略正在临床研究中积极探讨。此外，CD56和程序性死亡配体1（PD-L1）是探索性生物标志物，因为这些标志物的表达可能有助于区分恶性MM PCs与正常PCs。目前，MM1.S细胞系因表达关键CAR T治疗靶点BCMA和GPRC5D，常被用作MM临床试验中新鲜样本检测的检测质控品。

然而，尽管MM1.S细胞系强表达BCMA和GPRC5D，但其缺乏PC和B细胞鉴定所需的关键标志物，如CD45和CD19。此外，MM1.S细胞系表现出与患者样本不同的散射和表型特征，往往需要独立的设门策略。近期研究已证明合成性、生物学代表性材料的可行性、准确性和精密度。为解决上述局限，研究人员与Slingshot Biosciences公司合作开发并表征了一种合成MM细胞模拟物，旨在为临床流式细胞术应用提供具有代表性、标准化的检测质控品。

二、主要关键技术方法

研究人员采用符合CLSI H62指南和近期流式细胞术方法验证建议的“适用目的”（fit-for-purpose）分析验证方法。精密度评估涵盖四种方式：批内精密度（单次运行内的重复测量）、批间精密度（不同日期进行的独立运行）、仪器间精密度（相同样本在多台Cytek Aurora仪器上分析）以及分析人员间精密度（不同分析人员独立制备和采集）。稳定性评估采用两种设计：基于37°C孵育并结合Arrhenius方程换算至?20°C储存的反向加速闭瓶储存研究，以及在4°C储存的重组后稳定性研究。纵向检测性能通过20次独立运行的Levey-Jennings分析进行监测。研究中使用的生物学样本包括来自三个供体的冻存MM骨髓单个核细胞（BMMCs），购自Discovery Life Sciences公司；MM1.S细胞系购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。

三、研究结果

3.1 MM细胞模拟物的表型

研究人员将八色流式细胞术panel应用于MM模拟物，以评估散射特征和标志物表达。如工程化设计所示，MM细胞模拟物的中位前向散射面积（FSC-A）和侧向散射面积（SSC-A）与三个代表性MM BMMC淋巴细胞群体相当。与设计意图一致，MM细胞模拟物表现出两个CD45群体，即CD45^bright和CD45^dim。CD45^bright群体仅CD19阳性，代表B细胞；CD45^dim群体CD19阴性，对CD38、CD138、GPRC5D、BCMA、PD-L1和CD56阳性，模拟PC群体。两个模拟物群体互为内部阴性对照。MM1.S的FSC-A约为MM模拟物的两倍，且缺乏CD45和CD19表达，而这两个标志物在MM细胞模拟物上均可检出。MM1.S和MM模拟物均显示BCMA和GPRC5D的强阳性信号。总体而言，MM细胞模拟物重现了MM BMMC样本中相关的散射特性和标志物表达模式，克服了MM1.S细胞系散射特征差异及CD45和CD19表达缺失的问题。

3.2 精密度

研究人员对MM细胞模拟物进行了批内、批间、仪器间和分析人员间精密度评估。GPRC5D AF647 MESF在批间、批内、仪器间和分析人员间精密度中的变异系数（CV）分别为7.46%、3.82%、5.26%和18.12%。BCMA PE MESF的CV分别为8.09%、3.54%、6.93%和14.36%。所有可报告参数均满足预设的≤20% CV接受标准，证明检测在各项分析参数上具有稳健的精密度。

3.3 MM细胞模拟物的稳定性

研究人员通过加速稳定性条件评估了MM细胞模拟物的长期储存稳定性。根据Arrhenius方程，37°C孵育0、4、7、11和14天分别对应?20°C储存约0、3、6、10和13个月。在所有评估的生物标志物中，相对于时间零点（T0），MFI变异在13个月等效时间点保持在20% CV以下，其中GPRC5D的CV最高，为16.92%。尽管GPRC5D在3个月和10个月等效时间点超过20% CV，但所有标志物在13个月时间点均满足预设接受标准。这些发现证明冻干MM细胞模拟物在?20°C储存条件下可保持稳定长达13个月。

重组后稳定性评估中，第3、5和7天所有标志物与第0天的差异均小于20%，唯第3天CD56 MFI增加了26.56%。该CD56的MFI增加可能归因于Cytek Aurora仪器每日增益设置的变动。

3.4 MM细胞模拟物的检测性能

研究人员在2个月期间进行了20次独立运行的MM细胞模拟物纵向检测性能评估，以生成Levey-Jennings图来识别趋势、偏移或离群值。在所有20次运行中，GPRC5D AF647 MESF和BCMA PE MESF的关键参数均保持在均值的±3个标准差（SD）范围内，表明检测性能稳定，适合常规质量控制监测。

四、讨论与结论

MM细胞模拟物解决了MM1.S作为检测质控品的关键局限性，展示了代表疾病患者样本的散射特性和标志物强度。验证评估证明了稳健的精密度、跨仪器和分析人员的可重现性能，以及闭瓶和重组后条件下的稳定性。MM细胞模拟物的一个关键优势是其可调性。检测质控品的重要功能是确认抗体 cocktails 和染色工作流程的完整性，尤其是在临床样本因疾病状态、样本处理或分析延迟而表现出表型变异时。将感兴趣标志物整合到合成细胞模拟物中作为检测质控品，能够更可靠地评估所有可报告参数的检测性能。另一个优势是操作便捷性：MM细胞模拟物储存于?20°C，无需液氮储存，重组后5分钟内即可使用，而细胞系质控品需要持续培养维护和批次制备。此外，MM细胞模拟物的可调性也使其非常适合抗体滴定和试剂批次间桥接。当前MM细胞模拟物是为支持正在进行的MM临床试验的探索性终点流式细胞术检测而开发的，保留了既定panel而未做修改。该平台的可调性使得未来可以纳入当前MM panel中的其他标志物，如CD117、CD27、CD28和CD81，进一步扩展其在更广泛MM panel中的实用性。

研究结论指出，MM细胞模拟物克服了当前检测质控品的局限性，具有与代表性疾病样本相似的散射特征，并表达了MM1.S细胞系所缺乏的标志物，如CD45和CD19。MM细胞模拟物和MM1.S均稳健表达关键标志物BCMA和GPRC5D。最终，合成细胞模拟物扩展了工具库，为传统细胞系提供了互补的替代方案。