《Clinical and Translational Discovery》：Exploring the role of monocyte in pulmonary embolism via single-cell transcriptome sequencing of peripheral blood
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背景：研究表明炎症在肺栓塞（PE）的发生发展中至关重要，但很少有研究专门关注单核细胞的作用。本研究旨在通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）探索急性PE过程中单核细胞的病理反应，为PE的早期识别、干预和治疗提供细胞和遗传学见解。
方法：本研究招募了2021
背景：研究表明炎症在肺栓塞（PE）的发生发展中至关重要，但很少有研究专门关注单核细胞的作用。本研究旨在通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）探索急性PE过程中单核细胞的病理反应，为PE的早期识别、干预和治疗提供细胞和遗传学见解。
方法：本研究招募了2021年7月至2021年12月在复旦大学附属中山医院接受诊断和治疗的5例PE患者，并利用了GEO数据集GSE149689（GSM4509015、GSM4509023、GSM4509024和GSM4509029）中4名健康志愿者的公开PBMC scRNA-seq数据。最初收集了15份PE时间点样本；其中1份PE第3天样本因未通过质量控制而被排除，最终剩余14份PE样本和4份健康供者样本，共计18份外周血单细胞测序数据集。
结果：外周血单个核细胞的通讯信号在PE期间发生动态变化。单核细胞中的炎症调节基因沿细胞发育轨迹表现出显著变化，并且单核细胞功能障碍贯穿PE的发生发展全过程。CD16+单核细胞和CD16-单核细胞中的ANNEXIN信号通路可能发挥重要作用，特别提示CD16+单核细胞与CD16-单核细胞之间的通讯是PE进展的一个指标，并可能参与PE加重和恢复的调控。S100钙结合蛋白A8/A9（S100A8/A9）基因和铁蛋白重链1/轻链（FTH1/FTL）基因也可能在PE中发挥关键作用。
结论：CD16+单核细胞和CD16-单核细胞在PE期间表现出病理反应。ANNEXIN通路、S100A8/A9基因和FTH1/FTL基因也可能发挥重要作用。
研究背景与科学问题
肺栓塞（Pulmonary Embolism, PE）是一种常见且危及生命的重症心血管疾病，高危PE患者常伴有动脉低血压或休克，短期和长期死亡率均较高。大量研究已证实炎症反应在PE的发生与发展中扮演关键角色，外周血炎症指标可用于预测PE的严重程度及短期死亡率。单核细胞作为重要的炎症细胞，能够与血小板和血管内皮细胞相互作用，加速氧化应激反应，促进血栓形成、血管痉挛和血管栓塞。然而，目前鲜有研究专门聚焦于单核细胞在PE病程中的具体作用机制。因此，利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术从单细胞层面深入探索单核细胞在急性PE中的病理反应，对于PE的早期识别、精准干预及靶向治疗具有重要意义。
研究方法概述
研究人员共纳入5例2021年7月至12月于复旦大学附属中山医院确诊的急性PE患者，并获取其诊断后第1天（PE-T1）、第3天（PE-T2）和第7天（PE-T3）的外周血样本，同时从公共数据库GSE149689中获取4例健康供者（HD）的外周血单个核细胞（PBMC）scRNA-seq数据作为对照。主要关键技术方法包括：利用BD Rhapsody系统进行单细胞捕获和文库构建，并在NovaSeq 6000平台进行测序；使用Seurat包进行数据预处理、降维聚类及细胞注释；应用CellChat工具分析细胞间通讯网络；采用Monocle2进行拟时序分析以推断单核细胞的分化轨迹；通过差异表达基因（DEG）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析揭示功能改变。
研究结果
3.1 构建PE患者外周血高质量单细胞图谱
研究人员成功获得46613个细胞的表达谱，平均每样本2589个细胞。HD组共15435个细胞，PE组共31178个细胞，其中PE-T1、PE-T2和PE-T3分别包含8717、11585和10876个细胞。
3.2 scRNA-seq数据描绘PE患者外周血主要免疫细胞图谱
通过t分布随机邻域嵌入（t-SNE）降维和无监督聚类，将所有细胞分为13个簇，经手动注释后鉴定出9种免疫细胞类型：CD16-单核细胞、CD8+T细胞、CD4+初始T细胞、自然杀伤（NK）细胞、CD4+中央记忆T细胞、初始B细胞、CD16+单核细胞、浆细胞和血小板。
3.3 单核细胞与其他免疫细胞的动态互作指示PE进展
整体细胞通讯网络分析显示，CD16-单核细胞和CD16+单核细胞与其他细胞的信号交换最为广泛，主要由白细胞介素-16（IL-16）、ANNEXIN、信号素4（SEMA4）和主要组织相容性复合体II类（MHC-II）信号通路主导。分阶段比较发现，与HD相比，PE-T1中CD16-单核细胞与CD16+单核细胞间的ANNEXIN信号减弱，PE-T2完全消失，PE-T3恢复；CD16+单核细胞与CD4+中央记忆细胞间也呈现类似的减弱-消失-恢复过程。这提示ANNEXIN信号通路可能在PE发生发展中发挥重要调控作用。
3.4 CD16-和CD16+单核细胞炎症调控基因在拟时序分析中呈状态依赖性变化
拟时序轨迹分析揭示了从CD16-到CD16+单核细胞的连续分化轨迹。PE-T1时期出现明显分支，表明急性期单核细胞成熟过程受到干扰；PE-T2时分叉减弱；PE-T3时轨迹基本恢复至接近健康对照。进一步分析显示，S100钙结合蛋白A8（S100A8）和S100A9的表达主要集中在发育轨迹末端的CD16-单核细胞中，且在PE各时间点较HD显著升高，随时间推移逐渐恢复。Toll样受体4（TLR4）、核因子κB1（NFKB1）和NFKB2的表达则无明显细胞类型特异性。
3.5 单核细胞功能障碍伴随PE全程
主成分分析（PCA）显示，除CD16-和CD16+单核细胞外，其余7种细胞类型在PE-T3阶段趋向HD组，而两种单核细胞持续维持病理反应状态。差异表达分析发现，CD16-单核细胞在PE各时间点与HD相比分别有1135、1161和1160个DEG，其中1092个基因为共有；CD16+单核细胞分别有1320、1326和1354个DEG，1222个共有。KEGG富集分析表明，两种单核细胞在PE全过程中均表现出代谢相关通路的显著改变，此外CD16-单核细胞还涉及氧化磷酸化、吞噬体和病毒感染相关通路，CD16+单核细胞则受剪接体相关通路调控。在基因层面，S100A家族基因（如S100A9、S100A8等）在两种单核细胞中持续显著上调，铁蛋白重链1（FTH1）和铁蛋白轻链（FTL）基因也呈现显著过表达。其中，S100A9在CD16-单核细胞和FTL在CD16+单核细胞中的表达倍数变化绝对值大于6，提示其可能是驱动单核细胞病理状态的核心基因。
讨论与结论
讨论部分指出，PE仍是心血管疾病死亡的主要原因之一，外周血炎症标志物可预测PE严重程度和短期死亡率。单核细胞可与血小板和血管内皮细胞相互作用促进血栓形成，但其在PE中的具体作用机制尚不明确。本研究发现CD16+和CD16-单核细胞在PE进程中始终处于病理反应状态，二者间的通讯及ANNEXIN信号通路可能成为PE进展的生物标志物和新治疗靶点。S100A8/S100A9可通过TLR4-NFKB通路放大炎症反应，且已有研究证实S100A8/A9与血小板GPIbα相互作用构成新的促血栓通路，抗S100A9疫苗可在无出血风险下长期抑制血栓形成，提示S100A8/A9是PE早期诊断和治疗的极具前景的靶点。此外，FTH1和FTL基因编码的铁蛋白在维持铁稳态和血管健康中发挥重要作用，其持续过表达可能通过影响代谢通路参与PE进程。研究人员同时指出本研究存在局限性，包括样本量较小且临床异质性较大、健康对照组来自公共数据集可能存在批次效应、以及缺乏蛋白质水平和功能性验证等。
研究结论：综上所述，本研究提示单核细胞（包括CD16+单核细胞和CD16-单核细胞）在PE病程中表现出病理反应。分析中鉴定了ANNEXIN通路，S100A8/A9和FTH1/FTL可能在PE的发生和进展中发挥关键作用。将临床特征表型与scRNA-seq特征相结合，全面探索了PE的病理生理状态，为精准诊疗提供了潜在的新干预靶点。
