整合性解析人肝细胞癌类器官模型及其HBV相关生物学特征

《Clinical and Translational Medicine》：Integrative characterization of human hepatocellular carcinoma-derived organoids and their HBV-associated biology

　　

背景：肝细胞癌（HCC）是最具侵袭性的恶性肿瘤之一，具有高度异质性。然而，HCC的治疗仍面临困难，这凸显了进一步明确HCC分子亚群并理解其与治疗反应潜在关联的必要性。 方法：本研究从20例确诊为HCC的个体中建立了20个患者来源类器官和12个患者来源细胞系。研究人员利用全外显子测序、RNA测序、药物筛选以及针对乙型肝炎病毒（HBV）的聚合酶链式反应（PCR），并重点关注HBV相关HCC，对这些模型进行了全面表征。 结果：基于转录组谱分析，本研究将HCC分为两个分子亚型，与既往报道的分型一致。药物筛选显示，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/AKT/mTOR）信号通路富集程度越高，对依维莫司和仑伐替尼的敏感性越高。整合转录组与药物反应分析进一步确定了与仑伐替尼反应相关的候选基因。此外，针对HBV表面、核心和X基因的PCR分析显示，与临床报告的HBV感染状态存在显著差异。值得注意的是，HBV DNA的检出与钙信号通路激活及奥沙利铂反应相关。 结论：本研究为探究HCC的生物学和药理学特征提供了宝贵资源，特别是在分子亚型和HBV相关机制方面。最终，这些发现为HCC异质性和药物反应提供了更多见解，并可能为进一步研究治疗反应的分子决定因素奠定基础。

论文解读文章

一、研究背景与目的

肝细胞癌（HCC）是全球第六大常见癌症，也是癌症相关死亡的第三大原因，约占原发性肝癌病例的75%至85%。乙型肝炎病毒（HBV）感染是HCC的主要病因之一，1990年全球超过50%的HCC病例与其相关，尽管到2019年这一比例降至42%，但在东亚地区疾病负担尤为沉重，约62%的HCC病例归因于HBV感染。HCC因其高度异质性、治疗选择有限以及对化疗药物反应不一，在治疗上构成重大挑战。因此，明确分子定义的HCC亚群并针对每个亚群制定个体化治疗策略至关重要。患者来源类器官提供了一个相关的临床前平台，能够在患者特异性背景下捕获肿瘤异质性并评估药物反应。此外，临床HBV状态通常通过血清学标志物（如HBsAg、HBeAg及其相应抗体）和检测血液中HBV DNA水平来评估，但这些检测无法反映HBV DNA整合或共价闭合环状DNA（cccDNA）的存在，而整合的HBV DNA片段可诱导基因组不稳定性和致癌基因的插入性激活，cccDNA则维持持续的病毒转录。因此，临床HBV标志物与基于PCR的HBV DNA检测可能提供反映HBV感染不同生物学层面的互补信息。本研究旨在通过建立患者来源的HCC类器官和细胞系模型，整合基因组、转录组、药理学及HBV相关分析，以更好地定义HCC分子亚型、理解其与治疗反应的关系，并探究HBV相关的分子特征。

二、研究设计与技术方法

研究人员从首尔国立大学医院接受手术切除的20例HCC患者中，成功建立了20个HCC来源类器官、3个相邻非肿瘤组织来源类器官以及12个HCC来源细胞系，并连同配对组织进行了整合性分子与药理学分析。样本队列来源于韩国患者。主要关键技术方法包括：全外显子测序用于分析体细胞突变谱；RNA测序用于转录组谱分析；基于3D类器官模型的药物敏感性试验，评估8种临床相关药物（索拉非尼、仑伐替尼、瑞戈非尼、多柔比星、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、他克莫司和依维莫司）的反应；针对HBV表面、核心和X基因的PCR分析以检测肿瘤内HBV DNA状态；以及siRNA介导的基因敲低实验进行功能验证。

三、研究结果

3.1 HCC来源类器官和细胞系的建立

研究人员建立了来自20例HCC患者的类器官和细胞系模型。HCC类器官主要表现出两种形态特征：出芽形成管腔的形态和实性致密无管腔的圆形形态，而相邻非肿瘤组织来源类器官则呈现囊状形态。苏木精-伊红染色显示肿瘤类器官的形态反映了其配对组织的形态。突变谱分析显示，TP53（35.3%的组织和42.1%的类器官）、CTNNB1、CDKN2A和RB1等HCC常见驱动基因的突变频率与公共数据库（TCGA-LIHC）及既往研究基本一致，表明这些模型忠实反映了HCC的突变谱。

3.2 类器官和细胞系与配对组织的比较

通过Spearman相关系数分析，肿瘤类器官在转录组水平上比细胞系更忠实地再现了其配对组织的表达谱。然而，肿瘤类器官和细胞系彼此之间的相似性高于它们与其他样本类型的相似性。正常类器官未保留其配对正常组织的样本特异性表达特征。突变比较分析显示，TP53、CDKN2A和RB1等肿瘤抑制基因的突变仅存在于肿瘤样本中，提示其作为HCC发生发展的关键致癌因素。

3.3 转录组分析确定HCC类器官的两种分子亚型

基于mRNA表达的无监督共识聚类分析，研究人员将18个HCC类器官分为两个分子亚型C1和C2。C1以分化良好特征为主，预后较好，富集凝血、脂质代谢、代谢和肝损伤相关通路；C2则富集初级纤毛、炎症、自噬和转移相关通路，预后较差。突变模式与既往报道一致：CTNNB1突变仅出现在C1中，而TP53突变在C2中更常见。

3.4 在TCGA-LIHC队列中验证C1/C2亚型分类

研究人员提取了92个与C1/C2亚型富集通路相关的特征基因，在TCGA-LIHC队列（n=361）中进行无监督共识聚类，成功再现了两个亚型。Kaplan-Meier生存分析显示C2亚型预后显著差于C1（p=.027，HR=1.638）。临床特征分析表明，C2亚型肿瘤分级更高、血管侵犯更频繁、分期更晚且ECOG体能状态更差。基因集富集分析显示，C1富集Myc靶点通路、未折叠蛋白反应和活性氧通路，而C2富集Hedgehog信号、转移和炎症相关通路。

3.5 HCC类器官对药物治疗表现出异质性反应

对18个HCC类器官进行8种药物筛选，结果显示依维莫司和仑伐替尼的AUC值在C1和C2亚型间存在显著差异，C2对这两种药物更敏感。GSVA分析显示C2中mTORC1介导信号富集分数更高，TCGA-LIHC交叉验证进一步证实PI3K/AKT/mTOR通路在C2中富集。这些发现表明PI3K/AKT/mTOR通路富集程度与C1/C2亚型对依维莫司和仑伐替尼的差异性敏感相关。

3.6 整合药物筛选和转录组分析提示仑伐替尼相关信号通路

通过计算基因表达与仑伐替尼敏感性之间的Spearman相关系数，研究人员鉴定出415个显著相关基因。GO富集分析显示这些基因涉及补体激活、炎症和嘧啶代谢等生物学过程。STRING分析发现补体和凝血级联通路中的17个基因显著互作，其中SERPINA5、VTN、C3和F11在C1中显著上调，且与仑伐替尼耐药正相关。siRNA敲低实验显示，F11敲低在三个类器官模型中一致增强了对仑伐替尼的反应，支持F11在仑伐替尼反应中的潜在作用。此外，嘧啶代谢通路中的DTYMK在C2中表达较高，其高表达与较低的仑伐替尼AUC值相关，提示其可能作为仑伐替尼敏感性的预测标志物。

3.7 HBV PCR结果与临床信息的比较

HBV PCR结果显示与临床数据存在显著差异。HBV表面基因PCR与临床数据的一致性在类器官、细胞系和组织中分别为70.0%、75.0%和56.3%；核心基因PCR的一致性分别为65.0%、66.7%和62.5%；X基因PCR的一致性分别为75.0%、66.7%和43.8%。类器官与配对组织间的一致性为68.8%至87.5%。临床HBV感染在C2中更普遍（90.0%），与既往研究报道的亚型特征一致。这些差异反映了临床标志物（反映全身病毒活性或宿主血清学状态）与PCR检测（反映肿瘤来源区室中保留的HBV DNA序列）代表不同的生物学层面，PCR可能提供肿瘤内HBV DNA状态的补充信息。

3.8 HBV相关钙信号失调与奥沙利铂耐药相关

基于HBV状态的差异表达基因分析显示，HBV PCR相关基因富集于细胞黏附、发育、mRNA剪接、增殖、解毒/外源物代谢、脂质代谢、氧化应激和炎症等生物学过程，这些通路均与钙信号相关。GSVA分析证实HBV阳性组中钙介导信号调控通路显著富集。药物反应分析显示，HBV阳性组对奥沙利铂表现出显著更高的耐药性，且奥沙利铂AUC值与钙介导信号通路GSVA评分正相关。在钙信号相关基因中，ATP2A1（编码肌浆/内质网Ca²⁺-ATP酶，SERCA）在TCGA-LIHC队列、类器官、细胞系和组织中均在HBV阳性组中一致下调。这些发现支持一个假设模型：HBV相关钙失调可能通过降低细胞外Ca²⁺水平阻碍奥沙利铂代谢，从而降低其疗效。

四、讨论与结论

讨论部分指出，本研究建立的HCC患者来源模型忠实再现了HCC的分子和病理特征。C1/C2亚型分类重现了既往报道的代谢型和增殖型HCC分型框架，并通过92个特征基因在TCGA-LIHC队列中得到验证。C2亚型对依维莫司和仑伐替尼的更高敏感性及其PI3K/AKT/mTOR通路富集，为已建立的HCC分子亚型增添了药理学维度。F11被鉴定为仑伐替尼反应的潜在决定因素。HBV PCR与临床数据间的差异可能反映隐匿性HBV感染、HBV DNA整合、cccDNA保留、肿瘤空间异质性或类器官/细胞系建立过程中HBV亚克隆丢失等生物学和技术因素。钙信号通路在HBV阳性样本中富集，ATP2A1下调可能与HBV相关钙失调有关。研究局限性包括样本量较小限制统计效力、未系统评估长期传代中的克隆选择和表型漂移、以及提出的机制关系未经实验验证。研究结论为：本研究呈现了新建立的HCC患者来源类器官模型及其全面的分子表征和药物敏感性谱分析，这些模型忠实再现了HCC的分子特征，通过整合基因组、转录组、药理学和HBV相关分析实现了分子亚型的表征，为HCC分子异质性、药物反应和HBV相关生物学提供了更多见解。