禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）高质量基因组与RcPL3-TaHDA9-TaRHC1A-TaRBOH3致病级联解析及HY-19741防控小麦纹枯病

《iMeta》：Infection mechanisms of Rhizoctonia cerealis in wheat

　　

禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis，Rc）作为引起小麦纹枯病（sharp eyespot，SE）的主要病原菌，严重危害全球小麦生产。研究人员在7年间从中国30个地点采集了1683株表现SE症状的小麦植株。研究人员随后通过对5个代表性Rc分离株进行从头测序（de novo sequencing）构建了高质量基因组图谱，并通过对207个分离株重测序建立了基因组变异图谱。研究人员鉴定了一个赋予Rc致病性的关键效应子RcPL3。RcPL3增加小麦细胞质中组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase）TaHDA9的蛋白积累，从而促进Rc侵染。TaHDA9通过去乙酰化（deacetylation）抑制E3泛素连接酶（E3 ubiquitin ligase）TaRHC1A。RcPL3通过介导TaHDA9间接抑制TaRHC1A的积累。TaRHC1A促进合成活性氧（reactive oxygen species，ROS）的TaRBOH3降解，从而引起小麦SE抗性。研究人员进一步发现拮抗剂HY-19741可阻止Rc侵染。Rc高质量基因组图谱和与SE相关的RcPL3-TaHDA9-TaRHC1A-TaRBOH3调控级联将对小麦SE防控具有重要价值。

该研究由Yan Ren等完成并发表于《iMeta》。小麦纹枯病（sharp eyespot，SE）由禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis，Rc）引起，是严重威胁全球小麦生产的土传病害。Rc不形成无性孢子，有性阶段在自然界可能罕见，主要以菌丝和菌核在病残体或土壤中存活。中国每年约800万公顷小麦受SE影响，单田产量损失可达10%–40%；欧洲因早播、感病品种和有利天气，SE发生上升。杀菌剂虽常用，但存在食品污染、非靶标影响和抗药性风险；寄主抗性更安全，但尚无免疫或高抗种质。Rc基因组信息有限，仅有少数菌株全基因组报道；其他病原效应子研究较多，而Rc效应子破坏小麦防御的机制不清楚。小麦SE抗性由数量性状位点（quantitative trait loci，QTL）控制，单个QTL效应小，正向遗传克隆困难。因此，研究人员采集大规模菌株、构建高质量基因组和变异图谱，筛选效应子并解析致病机制，以服务抗SE育种和防控。该论文发表在《iMeta》。

关键技术方法：样本来自中国30个地点2014—2020年的1683株SE病株，经单菌丝尖端法分离335株，rDNA内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）分类得到267株Rc；对5个代表性Rc分离株进行Illumina/PacBio Sequel和Hi-C从头测序，对207株重测序；开展RNA-seq、全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）、酵母双杂交（yeast two-hybrid，Y2H）、荧光素酶互补成像（luciferase complementation imaging，LCI）、pull-down、双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）、免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）、病毒诱导基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）、EMS突变体、过表达和CRISPR/Cas9；还使用虚拟筛选和温室接种。EMS突变体库为四倍体小麦Kronos，由University of California, Davis的J. Dubcovsky提供；使用AK58、ZM18、CS、YM49、Fielder、Pingyuan 50等小麦材料。

研究结果如下。

中国主要麦区SE病原采集与分类：研究人员于2014—2020年从中国30个地点采集1683株SE病株，分离335个菌株，经ITS测序将267株鉴定为Rc，Rc存在于30个地点中的22个，表明其为我国小麦SE主要病原。267株Rc在四个小麦品种上的平均病情指数（disease index，DI）为11.75–75.44，地区间致病性差异显著；系统发育显示79.8%属于AG-DI，20.2%可能为暂定新AG-DIV。

五个Rc分离株基因组测序与特征鉴定：对1个高致病、2个中等致病和2个弱致病AG-DI菌株进行Illumina和PacBio测序，组装基因组42.53–49.34 Mb，contig N50为1.78–2.89 Mb，BUSCO完整值94.83%–97.57%；3个菌株经Hi-C组装到染色体水平，平均93.75%序列锚定于12条染色体。基因组重复序列占24.29%–26.34%，LTR逆转座子最丰富；每个基因组预测10,697–12,296个蛋白编码基因，核心基因家族（core gene family，CGF）7551个，可变基因家族（dispensable gene family，DGF）3860个。

通过重测序构建Rc基因组变异图谱：对207个Rc分离株重测序，获得256.51 Gb clean data，平均24×覆盖，鉴定719,791个高质量单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）。结合基因组变异与致病性构建系统树，Cluster-1（主要来自四川、陕西和信阳）致病性显著强于Cluster-2（浙江、湖北）和Cluster-3（山东、江苏、安徽、河南除信阳），表明致病性与基因组变异密切相关。

与担子菌成员的进化及比较基因组学：将5个Rc基因组与6个担子菌和1个子囊菌基因组比较，鉴定15,435个直系同源组，其中77个Rc特异组含167个基因，且均属于Rc泛基因组DGF；Rc中87个基因家族扩张、11个收缩。Rc与R. solani最近，二者分化约232百万年前，Rhizoctonia与其他担子菌分化约337百万年前。

Rc泛基因组效应蛋白预测：在5个Rc基因组中预测到3757个潜在分泌蛋白，经EffectorP 2.0和KohGPI预测506个效应蛋白，各菌株含98–111个，归入105个基因家族。CGF主要含果胶裂解酶和RlpA样双ψβ桶，DGF主要含β/γ crystallin和3-脱氢奎尼酸合酶，这些为潜在致病相关基因。

R0301中致病效应基因鉴定：对R0301体外菌丝和侵染后3、5、7天的小麦幼苗进行转录组测序，检测13,675个表达基因，其中4435个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），2402个显著上调。结合98个预测效应基因，43个效应基因在侵染后显著上调，含DPBB、RlpA EXP_N、糖苷水解酶、LPMO、果胶裂解酶和SGNH水解酶等结构域。

Rc致病性GWAS：207个Rc分离株的DI为13.8–81.5，呈连续变异。GWAS在除4号染色体外鉴定16个重复显著SNP；连锁不平衡衰减距离0.48 kb，以200 kb区间纳入767个基因。结合43个上调效应基因，仅EVM0004929被GWAS鉴定，命名为RcPL3；其编码区有12个变异形成9个单倍型，RcPL3_HapB菌株DI低于HapA，qRT-PCR显示RcPL3在5 dpi显著诱导。

RcPL3在Rc致病性中发挥核心效应子作用：RcPL3为分泌蛋白，富含甘氨酸和苏氨酸，N端具信号肽；酵母SUC2系统证实信号肽具功能。RcPL3ΔSP可抑制BAX诱导的程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）。BSMV-VIGS沉默RcPL3降低DI和丙二醛，升高SOD、CAT和POD；小麦过表达RcPL3则增加DI、菌丝覆盖、细胞死亡和H₂O₂，表明RcPL3是关键致病基因。

RcPL3引起TaHDA9蛋白在小麦细胞质中积累：以RcPL3为诱饵进行Y2H筛库，筛选到组蛋白去乙酰化酶TaHDA9，并经Y2H、LCI、pull-down和BiFC证实互作，互作发生在细胞质。随Rc侵染，TaHDA9核内信号减弱、细胞质信号增强；免疫印迹显示RcPL3在核质中升高，TaHDA9在核中降低、质中升高，且磷酸化和赖氨酸乙酰化（Kac）水平升高。Alphafold2提示E94、D199、D266、R267和L268为关键互作位点，R267A显著削弱互作；RcPL3增加TaHDA9蛋白积累。

TaHDA9负调控小麦SE抗性：VIGS沉默TaHDA9降低DI；EMS突变体K733和K2217的DI和H₂O₂降低；过表达TaHDA9增加DI、菌丝覆盖、Rc生物量和H₂O₂；CRISPR/Cas9敲除TaHDA9降低菌丝覆盖、DI、H₂O₂和Rc生物量。480份小麦材料中，TaHDA9_HapB抗性显著强于HapA；TaHDA9R267A过表达也降低DI、Rc生物量和H₂O₂。

TaHDA9可能通过去乙酰化降低TaRHC1A蛋白积累：以TaHDA9为诱饵筛到E3泛素连接酶TaRHC1A，并经Y2H、LCI、Co-IP和pull-down证实互作，二者在细胞质互作。大肠杆菌中TaRHC1A可被乙酰化，TSA和NAM增强其Kac；TaHDA9在体外和体内降低TaRHC1A的Kac。质谱鉴定K222为关键去乙酰化位点，K222R降低Kac。TaHDA9降低TaRHC1A蛋白丰度，无细胞体系显示K222R下降更快，MG132可增加其丰度，提示经26S蛋白酶体降解。

TaRHC1A通过26S蛋白酶体泛素化促进TaRBOH3降解以降低ROS含量：VIGS沉默TaRHC1A升高DI；Kronos突变体rhc1a的DI和H₂O₂升高；过表达TaRHC1A降低DI、菌丝覆盖、细胞死亡、Rc生物量和H₂O₂。TaRHC1A可清除ROS，TaHDA9抑制该能力，RcPL3、TaHDA9和TaRHC1A共表达时ROS积累增加。TaRHC1A-OE转录组显示6个TaRBOH基因下调、28个抗氧化酶基因上调。Y2H和pull-down证实TaRHC1A与TaRBOH3互作，TaRHC1A降低TaRBOH3蛋白量，MG132抑制该降低；VIGS沉默TaRBOH3降低DI、Rc生物量和H₂O₂。此外，TaRHC1A也可通过泛素化介导TaHDA9降解。

RcPL3增强TaHDA9对TaRHC1A的去乙酰化：烟草共表达显示，RcPL3降低TaRHC1A的Kac和蛋白水平；RcPL3-OE小麦中TaRHC1A蛋白和Kac降低，TaRBOH3升高。Y2H显示RcPL3不与TaRHC1A直接互作，但与TaHDA9强互作，表明RcPL3通过TaHDA9间接影响TaRHC1A。

HY-19741具有抗真菌活性：通过虚拟筛选FDA批准药物库，经三轮对接筛选候选化合物，阈值?10.00 kcal/mol，前10个中5个低成本化合物用于琼脂扩散试验。HY-19741显著抑制Rc生长；预测其与RcPL3互作，竞争pull-down证实HY-19741削弱RcPL3与TaHDA9互作。外源HY-19741增强小麦SE抗性，降低TaHDA9和TaRBOH3蛋白，增加TaRHC1A，并上调ROS相关基因。

讨论部分总结：SE是毁灭性病害，2024年中国约800万公顷小麦受影响，年经济损失超过1500万美元；杀菌剂防控存在抗性、污染和成本问题，抗性种质有限。Rc基因组资源不足，RcPL3同源物仅见于Rhizoctonia真菌，提示其为Rhizoctonia特异性蛋白。小麦为异源六倍体、基因组巨大，正向遗传克隆抗SE基因困难；以效应子靶向的感病因子为切入点可提供新策略。Kac是可逆蛋白翻译后修饰，在植物免疫中发挥作用；HDA9可去乙酰化非组蛋白，本研究确认TaHDA9负调控SE。TaRHC1A为RING型E3连接酶，正调控SE抗性，通过降解TaRBOH3降低ROS。ROS可诱导细胞死亡，对死体营养和半活体营养病原可能有利；本研究中ROS积累促进Rc侵染，清除ROS增强抗性。RcPL3-TaHDA9-TaRHC1A-TaRBOH3模型调控ROS介导的SE感病性，HY-19741可干扰该过程。

研究结论翻译：研究人员对5个Rc基因组测序，并在大规模基因组重测序后构建了Rc变异图谱。研究人员进一步揭示了Rc致病机制，即效应子RcPL3招募TaHDA9抑制TaRHC1A，导致ROS积累，从而促进Rc侵染小麦植株。此外，研究人员证明拮抗剂HY-19741可用于SE病害防控。然而，解释结果时应注意本研究的局限性。首先，研究人员构建了高质量基因组图谱并鉴定了禾谷丝核菌关键毒力效应子RcPL3。由于目前缺乏有效方法产生Rc突变体，研究人员仅通过VIGS和在小麦中过表达验证RcPL3功能。未来工作中，产生RcPL3敲除突变体，例如通过构建非同源末端连接缺陷的Rc分离株以提高获得RcPL3突变体的概率，可提供更直接证据。第二，小麦中三个同源基因的贡献未被充分解析。最后，化合物HY-19741的靶标特异性尚未明确建立，需要更多数据支持。