基于表型药物发现的新型黄酮类衰老细胞清除剂（Senolytics）可减少衰老并改善多项健康寿命标志物

《Aging Cell》：Novel Flavonoid Senotherapeutics Identified by Phenotypic Drug Discovery Reduce Senescence and Improve Multiple Markers of Healthspan

摘要专业翻译 衰老细胞是驱动衰老进程的关键因素，并参与众多年龄相关疾病的发生发展。衰老细胞清除剂（Senolytics），即能够选择性清除衰老细胞的药物，为治疗年龄相关疾病提供了极具前景的治疗策略，但其临床转化面临重大障碍。天然黄酮类衰老细胞清除剂漆黄素（Fisetin）已进入临床试验阶段，但受限于疗效欠佳和生物利用度低。为应对这些挑战，研究人员采用整合性表型药物发现（Phenotypic Drug Discovery）策略，开发了两种新型漆黄素衍生黄酮类衰老细胞清除剂SR29384和SR31133。这些化合物表现出增强的衰老细胞清除活性，可靶向多种衰老细胞类型，在小鼠衰老模型中减少组织衰老并改善健康寿命（Healthspan）相关参数。结合转录组学、机器学习、网络药理学和分子对接的机制研究揭示，这些新型衰老细胞清除剂可能靶向关键分子通路，包括PARP1、CDK2，以及可能的BCL-xL，从而选择性诱导衰老细胞凋亡。这些发现提供了具有高临床转化潜力的新型衰老细胞清除剂，有望应用于促进健康衰老和治疗年龄相关疾病的临床实践。

论文解读

一、研究背景与科学问题

衰老是多数限制健康寿命（Healthspan）疾病和状态的首要风险因素。随着预期寿命延长，年龄相关疾病对医疗系统和经济造成的负担日益加重，全球年度成本预计达数万亿美元。这一人口结构变化凸显了亟需针对衰老根源进行干预以同时治疗多种疾病的策略。细胞衰老（Cellular Senescence）是一种由DNA损伤或氧化应激等压力源诱导的稳定细胞周期停滞状态，正逐渐被认为是衰老最基本的根源或标志之一。随年龄增长，衰老细胞在组织中累积并分泌一系列有害信号，统称为衰老相关分泌表型（Senescence-Associated Secretory Phenotype, SASP），包括促炎细胞因子、趋化因子、蛋白酶、核酸和代谢物等，通过旁分泌和内分泌信号加剧组织功能障碍并促进系统性炎症，形成加速衰老的正反馈回路。

转基因小鼠模型研究已证实衰老细胞在驱动衰老和年龄相关疾病中的关键作用。然而，目前有效衰老细胞清除剂的数量仍然有限。达沙替尼（Dasatinib）与槲皮素（Quercetin）联用、Navitoclax和漆黄素等多数已知衰老细胞清除剂面临生物利用度差、毒性高或疗效有限等挑战。漆黄素作为天然黄酮类化合物，在临床前研究中显示出衰老细胞清除潜力，并已推进至多项临床试验，但其并非强效衰老细胞清除剂，细胞培养中需要高剂量才能实现衰老细胞清除，且药代动力学性质不佳，如溶解度和吸收率低，可能限制其临床有效性。此外，漆黄素靶向多条通路的混杂性使其分子机制复杂，传统的基于结构的药物设计方法难以适用于开发新型衰老细胞清除黄酮类似物（Flavonoid Analogs, FAs）。因此，亟需开发更有效、更具选择性且药代性质更优的新型衰老细胞清除剂。

二、研究内容与主要结论

研究人员采用表型药物发现策略，以漆黄素为起点开发优化的衰老细胞清除剂。通过结构-活性关系（Structure-Activity Relationship, SAR）分析和临床前测试，成功开发了两种新型黄酮类衰老细胞清除剂SR29384和SR31133。临床前研究表明，这些新型黄酮类衰老细胞清除剂能在衰老小鼠模型中有效减少组织衰老并改善健康寿命相关标志物。综合机制研究揭示，这些化合物通过调控PARP1和CDK2等关键分子靶点选择性诱导衰老细胞凋亡。这些新型化合物代表了具有临床转化潜力的衰老靶向治疗候选药物。

三、关键技术方法

研究人员主要运用了以下关键技术方法：基于SA-β-gal活性的高通量表型筛选平台，配备高内涵荧光成像系统，用于评估化合物的衰老细胞清除和衰老调节活性；结构-活性关系（SAR）分析指导的迭代药物设计与化学合成；转录组学分析（RNA-Seq）结合基因集富集分析（GSEA）；基于深度自归一化卷积神经网络（DSNNN）的PathwayMap通路相互作用预测算法；基于相似性匹配的SwissTargetPrediction靶点预测；STRING蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建与k-means聚类分析；分子对接模拟；以及体外酶活性抑制验证实验（PARP1比色法、CDK2发光法、BCL-xL TR-FRET法）。动物实验使用自然衰老的野生型C57BL/6J小鼠（28月龄）和Ercc1^?/Δ早衰小鼠模型。

四、研究结果

4.1 天然黄酮类化合物的表型药物筛选

研究人员利用基于SA-β-gal活性的筛选平台，对包含黄酮、黄酮醇、黄烷醇、花青素等亚类的天然黄酮化合物库进行了衰老细胞清除活性筛选。结果显示，漆黄素的衰老细胞清除EC₅₀约为22.74 μM，选择性指数（Selectivity Index, SI）仅为1.53，表明需要进一步优化。在所有筛选化合物中，木犀草素（Luteolin）在MEF细胞中表现出最强效和最选择性的天然黄酮衰老细胞清除活性，EC₅₀为14.21 μM，SI为2.33。

4.2 SAR分析指导黄酮类化合物优化

基于表型筛选结果，研究人员建立了黄酮结构各部分的SAR指南。骨架方面，保留C2-C3双键和C4-氧代基团的平面黄酮和黄酮醇骨架表现出一致的衰老细胞清除活性，而缺乏该共轭结构的黄烷醇或具有替代核心化学结构的花青素、异黄酮和黄烷酮基本无活性。A环方面，5-羟基的存在降低活性，甲氧基等给电子取代基有利，但过多甲氧基取代导致化合物在培养基中沉淀。B环方面，3′,4′-二羟基的存在至关重要。C环方面，3-羟基的存在不利于活性，糖基化修饰降低活性。

4.3 SAR指导的迭代设计优化

研究人员设计、合成并测试了35种新型黄酮类似物。其中，具有叔丁基（化合物17）和异丙基（化合物18/SR29384）等无环脂肪族取代基的化合物显著增强活性。SR29384成为所有设计FA中选择性最高的衰老细胞清除剂。五元或六元全碳脂环取代基进一步增强了活性，SR31133（化合物22）表现出最高效力，EC₅₀为0.8 μM，相比漆黄素活性提高超过27倍。与漆黄素相比，SR29384和SR31133的衰老细胞清除活性分别提高了2.9倍和27.5倍。两种FA均表现出更高的亲脂性（WLogP分别为3.99和4.53，漆黄素为2.28）和更低的拓扑极性表面积（TPSA），与更好的血脑屏障（BBB）通透性相关。

4.4 优化黄酮类似物的广谱衰老细胞清除活性

SR29384和SR31133在多种衰老细胞模型中有效减少C₁₂FDG阳性衰老细胞，包括Ercc1^?/? MEFs、氧化应激或基因毒性应激诱导的WT MEFs、依托泊苷诱导衰老的人IMR90成纤维细胞以及复制性衰老的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。RT-qPCR验证显示，两种化合物显著下调Cdkn2a（p16^Ink4a）、Cdkn1a（p21^Cip1）和Il6的表达。

4.5 小鼠研究证实组织衰老减少和健康寿命标志物改善

在28月龄自然衰老野生型C57BL/6J小鼠中，以20 mg/kg剂量连续5天口服给药。SR29384显著降低多个组织（肾、脑、肺、脾、脂肪、肌肉）中衰老标志物p16^Ink4a和p21^Cip1以及多种SASP因子（Il6、Il1β、Mcp1、Pai1）的表达。在Ercc1^?/Δ早衰小鼠中，SR29384以20 mg/kg每周三次口服给药5周，有效抑制了衰老症状综合评分，特别是肌张力障碍和共济失调，并在肾、肝、肺和脑等多个组织中显著降低或呈降低趋势的衰老和SASP因子表达。

4.6 整合转录组学、计算和生化分析确定PARP1、BCL-xL和CDK2为潜在靶点

DPPH自由基清除实验显示所有化合物具有相似的抗氧化活性，排除抗氧化差异作为增强活性原因。RNA-Seq分析显示SR29384和SR31133处理降低SenMayo基因集富集，激活缺氧、p53信号和多种应激信号通路，下调G₂/M转换、E2F靶点和DNA复制过程。PathwayMap预测显示两种FA与木犀草素和达沙替尼聚类。经负对照过滤后，SR29384和SR31133分别靶向49和44种蛋白质，共享29个重叠靶点。共享靶点聚类为p53信号与细胞周期调控、雌激素受体活性和PARP信号三个主要簇。结合转录组过滤和网络扰动分析，确定PARP1、CDK2和BCL-xL为两种FA共享的最佳潜在蛋白靶点。分子对接显示SR29384和SR31133可竞争性结合PARP1催化腔和CDK2 ATP结合腔，但对BCL-xL的BH3结合位点无强结合。酶活性验证实验证实SR31133强效抑制PARP1（IC₅₀=2.51 μM），甚至优于标准PARP1抑制剂3-AB；SR31133和SR29384分别以IC₅₀=12.73 μM和58.33 μM抑制CDK2激酶活性。但两种FA均未在100 μM浓度下改变BCL-xL与其配体底物的结合。在衰老IMR90细胞中，PARP1抑制剂奥拉帕利（Olaparib）显著降低多种SASP基因表达并适度减少SA-β-gal阳性细胞百分比；CDK2抑制剂星孢菌素（Staurosporine）降低SASP基因和p16^Ink4a表达。

五、讨论与结论

本研究表明，通过整合表型药物发现策略成功开发了两种新型黄酮类衰老细胞清除剂SR29384和SR31133。这些化合物相比漆黄素表现出显著增强的衰老细胞清除活性，能有效靶向多种衰老细胞类型，减少小鼠组织衰老并改善选择性健康寿命相关表型。机制研究确定了PARP1和CDK2作为关键蛋白靶点，并阐明其在DNA损伤修复、凋亡和应激反应中的作用。SR29384独有靶点富集于前列腺素和其他促炎介质、ECM分解和免疫细胞激活信号通路，这可能解释其显著的选择性。SR31133独有靶点富集于组蛋白去乙酰化过程，提示HDAC抑制可能在其衰老细胞清除机制中发挥作用。研究还提出PARP1、CDK2和BCL-2家族蛋白之间存在广泛交叉对话，FA可能通过多靶点打击机制在衰老细胞中稳健诱导凋亡过程，涵盖DNA损伤反应、促死亡应激信号和抗凋亡机制抑制。这些发现不仅扩充了衰老治疗药物的武器库，也凸显了整合方法在连接化学与生物学以应对衰老和年龄相关疾病复杂挑战中的力量。