《Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle》：A 5:2 Intermittent Fasting Regimen Ameliorates High-Fat Diet-Induced MASLD-Associated Skeletal Muscle Impairment in Mice
编辑推荐：
背景：代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是全球高度流行的慢性肝脏疾病，其发病机制与高脂饮食（HFD）密切相关，并常伴随骨骼肌质量下降。虽然间歇性禁食（IF）已被证明可有效减轻肝脏脂肪变性和炎症，但其对骨骼肌质量的影响仍不清楚。
方法：8周龄雄性C57B
背景：代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是全球高度流行的慢性肝脏疾病，其发病机制与高脂饮食（HFD）密切相关，并常伴随骨骼肌质量下降。虽然间歇性禁食（IF）已被证明可有效减轻肝脏脂肪变性和炎症，但其对骨骼肌质量的影响仍不清楚。
方法：8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为两组，分别喂饲正常饲料（NC）或45% HFD 14周以诱导MASLD。随后，MASLD模型小鼠接受5:2间歇性禁食（IF5:2）方案12个周期（每周禁食2天，其余5天自由摄取HFD）。处死时测量握力、肝脏重量和股四头肌质量。收集血清样本用于生化分析和脂多糖（LPS）测定。采集肝脏、骨骼肌和肠道组织进行组织病理学检查。粪便样本通过宏基因组测序分析。通过qRT-PCR检测胆汁酸受体和炎症基因mRNA表达。在肝脏和骨骼肌组织中进行靶向游离脂肪酸（FFA）谱分析。
结果：与持续HFD组相比，IF5:2组累积能量摄入无显著差异，但体重显著降低，肝脏脂肪变性和炎症减轻。IF5:2显著增加握力和骨骼肌横截面积，并显著下调肌肉组织中炎症相关基因mRNA表达。关于肠道屏障功能，与HFD组相比，IF5:2组肠道紧密连接相关基因mRNA表达显著升高，结肠壁更厚，血清LPS水平更低。宏基因组分析提示IF5:2有效重塑HFD诱导的肠道菌群失调，并显著富集有益菌，包括Limosilactobacillus reuteri和Faecalibaculum rodentium，伴随微生物次级胆汁酸（SBA）生物合成途径显著上调。IF5:2组肠道、肝脏和骨骼肌中胆汁酸受体及其下游调控基因mRNA表达水平显著升高。IF5:2处理显著降低肝脏和骨骼肌中FFA水平，其与这两种组织中胆汁酸相关受体基因表达呈负相关。
结论：周期性IF5:2有效改善HFD诱导的MASLD并防止骨骼肌损伤。它代表一种有前景的饮食干预，具有减轻肝脏脂肪变性和维持骨骼肌质量的双重有益作用。
研究背景方面，代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是全球最常见的慢性肝病，其发病与高脂饮食（HFD）、肠道菌群失调和代谢失衡密切相关。持续肝脏代谢紊乱可通过炎症介导通路和异常代谢物产生损害骨骼肌健康并加速肌萎缩，越来越多证据表明MASLD伴随骨骼肌量下降。因此，开发既能改善MASLD又能保护骨骼肌的非药物干预具有重要临床意义和研究价值。间歇性禁食（IF）主要包括隔日禁食、整日禁食和时间限制进食（TRF）。5:2间歇性禁食（IF5:2）属于整日禁食，即每周2个非连续禁食日，其余5天自由进食。已有研究显示IF5:2可降低体重、减轻肝脂肪变性和炎症，但IF对骨骼肌质量的影响不一致：部分研究提示连续长时间禁食不改变肌肉代谢或性能，也不诱导结构或炎症改变；其他研究提示禁食方案可能不利于肌肉蛋白代谢和净肌肉蛋白平衡；部分研究报道IF在降低体重时可能降低瘦体重，尽管不足以引起肌萎缩。多数临床IF研究缺乏全面骨骼肌质量评估，IF对肌肉质量的直接确定影响仍不清晰。TRF在啮齿动物中显示直接有益于骨骼肌重塑，但其持续时间和频率不同于IF5:2；每周三次24 h禁食的小鼠研究更接近IF5:2，显示IF增强肝脏自噬但未激活骨骼肌自噬。因此，IF对骨骼肌质量影响不一致，且缺乏对肝脏和肌肉损伤的联合直接研究。基于此，研究人员采用HFD诱导MASLD小鼠模型，给予12周IF5:2，以验证其是否同时改善MASLD并保护骨骼肌免受损伤。
主要关键技术方法方面，研究使用7周龄雄性C57BL/6J小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd.），适应1周后随机给予正常饲料（NC）或45% HFD 14周诱导MASLD；建模确认后，将剩余HFD小鼠按体重随机分为持续HFD组和IF5:2组，IF5:2为每周2个非连续禁食日、其余5天自由摄取HFD，共12周。处死时处于喂食状态。关键技术包括握力测定、血清生化与酶联免疫吸附试验（ELISA）、肝脏/肠道/骨骼肌H&E和油红O及免疫组化、粪便宏基因组测序、qRT-PCR（2
?ΔΔCt法定量）、肝脏和骨骼肌靶向FFA的气相色谱-质谱（GC-MS）分析及统计。
研究结果如下。3.1 IF5:2改善HFD诱导的小鼠MASLD：14周HFD后，HFD小鼠体重、血清葡萄糖、血脂、ALT和AST显著升高，肝组织病理证实MASLD模型成功建立。12周IF5:2干预后，IF5:2组体重、血清TG、TC、ALT、AST显著降低，肝体比下降，肝脏大体形态改善，肝脂质蓄积和炎症减轻；大网膜、皮下、肾周和附睾脂肪组织重量显著降低，棕色脂肪组织重量无显著差异。IF5:2与HFD组血糖无显著差异，原文提示可能因再喂养期补偿性多食；IF5:2再喂养时摄食显著增加，但每周累积食物质量、总能量和脂肪来源能量与HFD组相似，提示再喂养增食抵消禁食能量缺口。结论为IF5:2有效阻止HFD诱导MASLD进展并改善肝脂肪变性和代谢健康。3.2 IF5:2减轻MASLD小鼠HFD诱导的骨骼肌损伤和炎症：HFD喂养26周后骨骼肌纤维横截面积显著低于NC组，验证长期HFD导致MASLD小鼠肌肉损伤。IF5:2后股四头肌绝对质量未显著高于HFD组，但肌/体重比和按体重归一化握力显著增加，并接近NC组。线性回归显示仅HFD组体重与股四头肌质量呈显著正相关，提示体重增长幅度超过股四头肌质量增加。IF5:2组骨骼肌Il6和Tnf mRNA表达显著低于HFD组，肌纤维横截面积显著增大。结论为IF5:2不仅改善MASLD，还减轻HFD诱导的骨骼肌损伤。3.3 IF5:2增强肠道屏障功能并降低肠道通透性：HFD组肠壁厚度显著降低并伴明显炎症细胞浸润；IF5:2增加肠壁厚度并减轻炎症细胞浸润。qRT-PCR显示HFD组肠道屏障标志Muc2及紧密连接相关基因Tjp1、Cldn4和Ocln mRNA显著下调，而IF5:2组显著上调。血清LPS在HFD组显著高于NC和IF5:2组，IF5:2与NC无显著差异。结论为IF5:2有效缓解HFD诱导的肠道屏障损伤并增强肠道完整性。3.4 IF5:2可能深刻重塑肠道菌群结构并富集具有SBA生物合成潜力的菌群：粪便宏基因组测序的主坐标分析（PCoA）显示NC、HFD和IF5:2组明显聚类，IF5:2组菌群结构更接近NC组；α多样性分析显示三组微生物丰富度和均匀度无显著差异，提示IF5:2主要重塑群落结构而非改变总体多样性。物种水平上，Faecalibaculum rodentium在NC和IF5:2组为优势种，而与炎症相关的Mucispirillum schaedleri在HFD组富集，与HFD小鼠血清LPS升高一致。LEfSe分析识别Limosilactobacillus reuteri和Faecalibaculum rodentium为IF5:2组富集的特征有益菌。KEGG富集显示IF5:2组显著富集磷酸转移酶系统（PTS）通路和SBA生物合成通路，HFD组显著富集LPS生物合成通路。功能贡献分析显示HFD与IF5:2差异菌群主要贡献胆汁盐水解酶（BSH）活性，其中Faecalibaculum rodentium对BSH功能贡献最高。相关性热图显示IF5:2富集的有益菌总体与肌肉力量正相关、与肝功能和代谢参数负相关；HFD富集促炎菌呈相反相关模式。部分相关未达统计学显著性，但趋势一致。结论提示IF5:2介导的菌群重塑可能增强肠道胆汁酸代谢遗传潜力，并与宿主代谢健康改善相关。3.5 IF5:2上调肠道、肝脏和骨骼肌胆汁酸受体基因表达：与功能预测一致，qRT-PCR显示HFD组肠道和肝脏经典胆汁酸受体Fxr mRNA显著低于NC组，而IF5:2组显著升高。肝脏Fxr升高进一步抑制下游靶点Cyp7a1，IF5:2组Cyp7a1显著低于HFD组。IF5:2组肝脏Ppara及其下游靶基因Cpt1a和Acox1显著上调。Fgfr4（FGF15关键受体）及其共受体Klb在IF5:2组肝脏和肌肉中显著升高。骨骼肌胆汁酸响应受体Tgr5在IF5:2组显著升高，Pkaca表达增加，而其下游抑制靶点Foxo3及肌萎缩相关基因Trim63和Fbxo32显著下调。结论提示胆汁酸信号可能贡献IF5:2在肝脏和肌肉中的代谢益处。3.6 IF5:2显著降低肝脏和骨骼肌FFA水平：靶向FFA谱分析显示，正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）中HFD组与NC和IF5:2组清晰分离，组内聚类紧密；置换检验Q
2<0，提示模型未过拟合。IF5:2组肝脏和骨骼肌总FFA含量显著低于HFD组，与NC组无显著差异。热图显示C16:0、C18:1、C18:2、C18:3n-3、C18:4和C18:3n-6在IF5:2组肝脏和肌肉中较HFD组显著降低，为两组织共享差异FFA。结论为IF5:2有效减少肝脏和肌肉脂质蓄积并缓解代谢损伤。3.7 胆汁酸受体/下游基因与肝脏和骨骼肌FFA谱的相关性分析：Spearman相关分析显示，肝脏中经典胆汁酸受体Fxr及其下游靶基因表达总体与差异FFA显著负相关，Klb和Fgfr4也与多种差异FFA显著负相关，而Cyp7a1与差异FFA正相关；原文解释为肝脂质蓄积抑制FXR信号，Cyp7a1作为Fxr经典负反馈靶点受FXR-SHP轴转录抑制，FXR活性降低可解除该抑制。骨骼肌中，Tgr5与C16:0负相关最显著；Foxo3及两个萎缩基因总体与FFA正相关，而Pkaca与FFA负相关。结论支持IF5:2可能通过重塑肠道菌群失调、调节胆汁酸受体信号和脂肪酸代谢来改善MASLD并保护骨骼肌。
讨论部分总结：近期IF5:2临床研究显示，MASLD患者IF5:2与脂肪量和糖化血红蛋白降低更多相关，但与持续能量限制相比，体重、瘦体重、胰岛素抵抗、甘油三酯或肝硬度无显著差异；IF5:2还可减轻西方饮食诱导的脂肪性肝炎。本研究支持IF5:2对HFD驱动MASLD和MASH进展的保护作用。未控制的MASLD导致进行性肝脂质蓄积和炎症加重，显著增加骨骼肌损伤风险；骨骼肌作为葡萄糖处置主要器官，其质量丢失促进胰岛素抵抗，进而加重MASLD。小鼠研究确认长期HFD加重肝脏和骨骼肌损伤，而IF5:2在高脂背景下同时改善MASLD并预防肌肉损伤。既往研究提示IF通过禁食和喂食状态间代谢转换增强代谢灵活性，迫使机体转换燃料来源并促进肝脏和肌肉储存脂质分解；IF5:2下肝脏和骨骼肌脂质处理和炎症状态改善可能部分归因于这种代谢重编程。然而，肝脏-骨骼肌代谢串扰的调控基础仍未完全明确。肠屏障完整性和菌群来源代谢物被认为是连接肠、肝和骨骼肌的关键介质。本研究中IF5:2改善肠屏障相关特征并重塑肠道菌群，包括富集与黏膜稳态相关的Faecalibaculum rodentium；既往研究将该菌与丁酸产生和紧密连接蛋白ZO-1、Occludin维持相关，提示其可能参与黏膜屏障稳态。通过维持肠屏障完整性，IF5:2可能减少微生物LPS泄漏入循环；HFD背景下循环LPS可诱导系统炎症、肝损伤和骨骼肌功能障碍。越来越多证据表明IF可调节肠道菌群组成并改善肠屏障功能。因此，IF5:2对肠屏障的保护可能是改善肝脏和骨骼肌代谢异常的起始步骤。除屏障保护外，结果提示IF5:2还可能通过菌群介导的胆汁酸代谢变化调节宿主代谢。IF5:2组高分特征菌中，Limosilactobacillus reuteri和Limosilactobacillus sp.已被证实具有BSH活性；尽管缺乏Faecalibaculum rodentium直接BSH酶活证据，已有研究显示该菌株参与初级胆汁酸向SBA转化。补充具有BSH活性的益生菌可改善血脂异常并减轻肝脂肪变性和炎症，这些效应与肠道胆汁酸代谢密切相关。作为胆汁酸受体关键配体，特定胆汁酸可激活肠道FXR信号并诱导FGF15表达；分泌的FGF15作用于肝脏FGFR4抑制Cyp7a1，而肝脏FXR-SHP信号进一步抑制胆汁酸合成并减轻胆汁酸诱导的脂毒性。同时，FXR信号也被报道可调节Ppara和Cpt1a表达，促进脂肪酸β-氧化并减少肝脂质蓄积。既往哺乳动物研究提示SBA生物合成增加可减少HFD诱导的脂质沉积；此外，SBA作为重要菌群来源代谢物也调节肌肉和脂肪组织中的系统免疫和能量代谢。因此，观察到的胆汁酸受体相关基因表达变化与IF5:2至少部分通过调节胆汁酸信号改善MASLD的可能性一致。重要的是，胆汁酸信号也可能贡献骨骼肌表型改善。既往小鼠研究提示肠道FXR-FGF15信号可能参与骨骼肌维持，循环FGF15可能通过FGFR4/KLB信号影响骨骼肌并减弱肌萎缩相关基因MuRF1和Atrogin-1表达，但该内分泌机制未在本研究中直接建立。此外，骨骼肌中胆汁酸激活的G蛋白偶联受体TGR5被报道在特定激动剂激活后改善肌肉代谢和功能。本研究中IF5:2上调骨骼肌Tgr5和Pkaca相关基因，其表达与棕榈酸水平负相关，而棕榈酸是已知诱导组织炎症的饱和FFA，提示胆汁酸受体信号可能参与减弱棕榈酸相关脂毒性应激。因此，这些结果支持胆汁酸受体信号可能促进减少肌肉脂质沉积并保护骨骼肌免受损伤。然而，人类和小鼠在肠道菌群组成、产BSH菌群和BSH酶性质方面存在显著差异；动物实验通常采用标准化HFD和短期干预，而人类研究受饮食习惯、基线代谢状态和肠道微生态高度异质性影响。BSH活性对人类MASLD肝脏代谢的净效应具有状态依赖性：升高的BSH活性可能介导保护性胆汁酸信号，也可能产生脂毒性SBA，取决于具体代谢背景。因此，需要额外人类研究确定IF5:2禁食下菌群介导的BSH活性增强是否有利于肝脏和骨骼肌代谢健康。尽管其他机制如肝源性外泌体通讯也可能介导肠-肝-肌串扰，但本研究数据初步提示IF5:2通过菌群依赖性调节屏障功能和胆汁酸代谢，对肝脏和骨骼肌发挥协调保护作用。局限与展望指出，研究在饮食诱导MASLD小鼠模型中进行，不能完全重现人类MASLD异质性；啮齿动物和人类在胆汁酸组成、代谢率、摄食行为和肠道菌群结构方面差异显著，因此BSH活性菌富集和胆汁酸受体信号下游激活需在人类受试者中验证。实验仅使用雄性小鼠，性别可显著调节IF5:2对肝脏和骨骼肌的调控效应，未来需验证雌性小鼠。机制证据仍主要为相关性，未来需结合粪便菌群移植、抗生素耗竭肠道菌群、IF5:2富集特征菌单定植，以及FXR或TGR5缺陷小鼠和受体特异性激动剂/拮抗剂进行功能验证。IF5:2在MASLD患者中的临床应用需谨慎评估，尤其老年、糖尿病、肌少症或蛋白摄入不足风险患者可能对禁食干预反应不同；临床试验应评估肝脏结局以及骨骼肌质量、肌力、饮食摄入、肠道菌群组成和胆汁酸谱，并通过长期临床试验系统评价IF5:2对肝脏和骨骼肌健康的影响。研究结论翻译：周期性IF5:2有效改善HFD诱导的MASLD并防止骨骼肌损伤。它代表一种有前景的饮食干预，具有减轻肝脏脂肪变性和维持骨骼肌质量的双重有益作用。
