靶向lncRNA PVT1/miR-145-5p/ABCC1通路增强紫杉醇敏感性并抑制黑色素瘤进展

《International Journal of Genomics》：Targeting lncRNA PVT1/miR-145-5p/ABCC-1 Pathway Enhances Paclitaxel Sensitivity and Suppresses Melanoma Progression

摘要专业翻译 背景：黑色素瘤作为一种高度侵袭性的皮肤癌类型，其细胞对多种化疗药物（如紫杉醇）表现出显著耐药性，这限制了治疗的有效性。已有研究强调了非编码RNA失调在黑色素瘤中的潜在作用，其影响肿瘤进展和药物反应，包括lncRNA PVT1。 目的：本研究探讨了同时调节lncRNA PVT1/miR-145-5p/ABCC1轴是否能够增强黑色素瘤细胞系对紫杉醇的敏感性并抑制恶性行为。 方法：研究人员使用SK-MEL-3和A375细胞，通过siPVT1进行PVT1敲低，通过转染恢复miR-145-5p功能，并单独或联合给予紫杉醇处理。采用MTT法评估细胞活力；通过流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期分布；通过qRT-PCR定量检测与凋亡、细胞周期调控、迁移和耐药相关的基因表达。 结果：与单一治疗相比，联合治疗显著降低了细胞活力。同时靶向PVT1和miR-145-5p显著增强了紫杉醇诱导的细胞凋亡，表现为促凋亡基因表达上调和抗凋亡基因表达下调。联合治疗还诱导了明显的G1期阻滞，伴随CDK-4和CDK-6水平降低。此外，基因表达分析显示MMP-9和ABCC1下调，E-钙黏蛋白上调，提示迁移潜能降低和耐药性逆转。 结论：同时敲低PVT1和过表达miR-145-5p通过促进凋亡、诱导细胞周期阻滞和缓解黑色素瘤细胞耐药性，增强了紫杉醇的抗癌效果。靶向PVT1/miR-145-5p/ABCC1调控网络可能为克服黑色素瘤化疗耐药提供有前景的治疗策略。

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一、研究背景与意义

黑色素瘤是一种起源于黑色素细胞的高度侵袭性皮肤癌，具有高转移潜能和对常规疗法的内在耐药性，构成重大的全球健康挑战。尽管靶向治疗取得进展，药物耐药仍是主要障碍。紫杉醇作为一种微管稳定剂，通过抑制微管解聚诱导G2/M期阻滞和凋亡，广泛用于多种恶性肿瘤的治疗，但临床疗效常因化疗耐药和剂量依赖性毒性的出现而受限。多药耐药与ATP结合盒（ABC）转运蛋白（如MRP1，即ABCC1）的过表达密切相关，这些蛋白通过ATP水解主动外排化疗药物，降低细胞内药物蓄积。

非编码RNA（ncRNA），特别是长链非编码RNA（lncRNA）和微小RNA（miRNA），通过调控凋亡、细胞周期进程、上皮-间质转化和药物外排相关基因参与耐药机制。lncRNA PVT1位于染色体8q24，是一种公认的致癌lncRNA，在多种恶性肿瘤中频繁过表达，通过海绵吸附肿瘤抑制性miRNA发挥致癌作用。相反，miR-145-5p是公认的肿瘤抑制性miRNA，通过直接靶向多种癌基因抑制癌细胞生长、转移和迁移，并已被证明可通过下调ABCC1等蛋白增加乳腺癌细胞对化疗的敏感性。

尽管PVT1、miR-145-5p和ABCC1在癌症中的各自作用日益明确，但它们在lncRNA PVT1/miR-145-5p/ABCC1通路中的联合相互作用，特别是在黑色素瘤紫杉醇化疗背景下的作用，尚需进一步研究。本研究旨在探讨黑色素瘤中该基因通路的表达变化，确定PVT1/miR-145-5p/ABCC1轴在黑色素瘤细胞系中的调控动态，并考察调节该通路对细胞活力、凋亡、迁移和紫杉醇反应的影响，以期识别克服黑色素瘤化疗耐药的潜在分子靶点。

二、研究内容与主要结论

研究人员在SK-MEL-3和A375人黑色素瘤腺癌细胞系中，通过siPVT1敲低PVT1、转染恢复miR-145-5p功能，并单独或联合给予紫杉醇处理，系统评估了该三联策略的抗肿瘤效应。研究得出以下核心结论：同时敲低PVT1和过表达miR-145-5p能够显著增强紫杉醇的细胞毒性和促凋亡作用，诱导G1期细胞周期阻滞，下调迁移相关和耐药相关基因表达，从而有效克服黑色素瘤的化疗耐药。该研究揭示了PVT1/miR-145-5p/ABCC1调控网络在黑色素瘤化疗耐药中的关键作用，为联合基因治疗和化疗的策略提供了实验依据，具有重要的转化医学意义。

三、关键技术方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：使用SK-MEL-3和A375人黑色素瘤细胞系（来源于伊朗巴斯德研究所细胞库）；通过电穿孔法进行siPVT1和miR-145-5p转染；采用MTT比色法评估细胞活力并计算半数抑制浓度（IC₅₀）；利用Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞术定量细胞凋亡；采用DAPI染色结合流式细胞术分析细胞周期分布；运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测凋亡、细胞周期调控、迁移和耐药相关基因的mRNA表达水平；使用GraphPad Prism和FlowJo软件进行统计分析。

四、研究结果

4.1 细胞活力结果

MTT实验显示，miR-145-5p和siPVT1单独处理未引起显著的细胞活力变化，而紫杉醇及联合处理表现出更明显的细胞毒性效应。miR-145-5p+siPVT1+紫杉醇三联组合在SK-MEL-3细胞中显示最低的细胞活力。紫杉醇在SK-MEL-3和A375细胞中的IC₅₀分别为45.3±2.1 μg/mL和56±5.6 μg/mL，而三联组合处理后IC₅₀分别降至12.8±1.2 μg/mL和40±3.5 μg/mL，表明联合处理显著增强了紫杉醇的细胞毒性。

4.2 凋亡分析

流式细胞术结果显示，对照组在两种细胞系中均显示低基础凋亡率（SK-MEL-3为1.91%，A375约为0.1%）。紫杉醇单独处理诱导约17.27%（SK-MEL-3）和21.36%（A375）的总凋亡率。双联组合显著增强凋亡：siPVT1+紫杉醇在SK-MEL-3和A375中分别达到约65.59%和58.8%的凋亡率；miR-145-5p+紫杉醇约为32.6%和23.10%；siPVT1+miR-145-5p约为6%和4.4%。值得注意的是，三联组合治疗诱导了最高的凋亡率，SK-MEL-3约为74.5%，A375约为77.3%，显著高于所有其他组。

4.3 细胞周期分析

DAPI染色流式细胞术分析显示，在SK-MEL-3细胞中，对照组G1期细胞占40.4%；siPVT1单独处理将G1期提高至51.2%；miR-145-5p单独处理提高至44.9%；紫杉醇单药治疗将G1期提高至48.8%。双联组合进一步增强了G1期阻滞，siRNA+药物、miR+药物和siRNA+miR处理分别显示约61.0%、60.2%和61.0%的G1期细胞。三联组合组效果最为显著，64.4%的细胞处于G1期，为所有组中最高水平，G2/M期最低（11.0%）。A375细胞呈现相似趋势：对照组G1期为33.2%；siPVT1单独处理产生单药中最强的G1期阻滞（52.6%）；三联组合产生最高的G1期阻滞（65.7%）。

4.4 基因表达分析

qRT-PCR结果显示，在SK-MEL-3细胞中，lncRNA PVT1表达在siRNA和联合组中显著下调，miR-145-5p表达在miR-145和联合组中显著上调。耐药基因ABCC1在紫杉醇组中表达显著增加，而联合处理尤其是三联组合显著降低了ABCC1水平。凋亡相关基因方面，促凋亡基因BAX、caspase-3、caspase-8和caspase-9在联合组中显著上调，抗凋亡基因BCL-2下调。细胞周期相关基因CDK-4和CDK-6在联合组中显著下调。迁移相关基因MMP-9在miRNA、双联和联合组中显著降低，而E-钙黏蛋白在联合组中显著升高。

五、讨论总结与研究结论

讨论部分指出，尽管免疫检查点抑制剂和BRAF/MEK靶向治疗目前是晚期黑色素瘤的标准治疗，紫杉醇等化疗药物仍用于特定患者。研究结果与现有文献一致：PVT1敲低通过下调MCL-1等机制诱导凋亡；紫杉醇在特定细胞类型中可诱导G1期阻滞而非G2/M期积累；PVT1沉默延长G0/G1期并减少S期。在分子机制层面，lncRNA PVT1作为竞争性内源RNA（ceRNA），通过海绵吸附miR-145-5p降低其与下游靶标（如ABCC1）的相互作用，间接上调ABCC1表达，促进药物外排和化疗耐药。miR-145-5p通过直接靶向ABCC1增强化疗敏感性。三联组合治疗在凋亡诱导和迁移/侵袭相关分子标志物调节方面均产生最优效果，表明同时靶向多条通路可增强治疗疗效并规避单药治疗常受限的耐药机制。

研究结论：体外研究结果表明，联合靶向lncRNA PVT1/miR-145-5p/ABCC1轴并联合紫杉醇可能对黑色素瘤细胞产生强效的组合抗肿瘤效应。具体而言，同时敲低PVT1和恢复miR-145-5p增强了紫杉醇敏感性，显著增加了凋亡性细胞死亡，诱导了G1期细胞周期阻滞，并下调了迁移相关和耐药相关基因（包括ABCC1/MRP1）。这些发现表明，共同靶向控制药物外排和生存信号传导的ncRNA网络可使黑色素瘤细胞对化疗敏感，可能代表一种克服化疗耐药的有前景的策略。尽管体外结果令人鼓舞，但这仅是初步步骤，在临床转化之前需要进一步的验证和优化。