《Ecological Applications》：DNA metabarcoding reveals key floral resources for native pollinators in post-fire landscapes
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野火是干旱黄松（Pinus ponderosa）森林生态系统中的一种自然干扰，且在整个北美西部，其发生频率和严重程度正持续增加。野火对生物与非生物条件的影响，对包括本土蜜蜂在内的更高营养级具有重要含义。研究人员旨在量化开花植物对火烧年限（burn age）和火
野火是干旱黄松（Pinus ponderosa）森林生态系统中的一种自然干扰，且在整个北美西部，其发生频率和严重程度正持续增加。野火对生物与非生物条件的影响，对包括本土蜜蜂在内的更高营养级具有重要含义。研究人员旨在量化开花植物对火烧年限（burn age）和火烧严重度（burn severity）的响应，并确定这些变化随时间对传粉者丰富度（pollinator richness）的影响。研究人员对2022年及2023年4月至8月间每两周部署的盆诱器（pan trap）和蓝板诱器（blue vane trap）中的花粉进行测序，以量化火烧后1–8年景观及未火烧区域中传粉者群落觅食资源的动态变化。对悬浮于蓝板诱器和盆诱器中的花粉进行DNA宏条形码（DNA metabarcoding）分析，揭示出多年生草本植物如欧蓍草（Achillea millefolium）、羽扇豆属（Lupinus spp.）及毛叶钟穗花（Phacelia hastata）是火后传粉者群落的关键花蜜资源。火烧年限和火烧严重度是植物-传粉者丰富度的主要驱动因子，且植物物种丰富度随火烧年限和火烧严重度的增加而增加。蜜蜂物种丰富度在不同火烧严重度间存在差异，这支持了将斑块镶嵌体（patch mosaic）与景观异质性管理作为火 reintroduction 的基本原则。研究结果强调了生物信息学阈值选择在植物名录生成中的重要性，并凸显了火烧年限、火烧严重度及植物丰富度在有效保护受火影响景观中传粉者物种方面的作用。该研究还采用了从诱器溶液中收集悬浮花粉这一新颖方法，用以量化昆虫传粉者的花蜜资源，凸显了诱器副产物在提供深入生态学信息方面的实用性。理解火后植物-传粉者关系，对于干旱森林被子植物区系及蜜蜂动物群的成功保护至关重要。
火后景观中植物与传粉者关系研究的背景与意义
野火是北美西部干旱黄松（Pinus ponderosa）森林生态系统中一种重要的自然干扰过程。近年来，受气候变化和长期火亏缺（fire deficit）累积效应的影响，该区域野火的频率和严重程度持续上升，对生态系统结构与功能产生了深远影响。火后植被群落的演替动态不仅决定了景观的物种组成，还直接关系到依赖花蜜和花粉资源生存的昆虫传粉者群落，尤其是蜜蜂（Hymenoptera: Anthophila）。蜜蜂在整个生活史中完全依赖花粉和花蜜，且许多种类具有花恒定性（flower constancy），其形态结构如花粉刷（scopa）和花粉篮（corbicula）也专门适应于花粉的高效采集与运输。因此，蜜蜂是提供传粉服务的最重要昆虫类群，也是量化植物-传粉者互作关系时需要重点考虑的关键类群。
然而，火后生态系统中植物与传粉者之间的精细互作关系长期缺乏系统性认知。传统研究方法如野外直接观察和显微镜花粉鉴定，受限于采集时间窗口较短、需要专门的分类学训练且耗时费力，往往难以全面捕捉传粉者实际访问的植物种类。此外，随着高严重度火烧导致的森林转换（forest conversion）风险增加，旱生植被可能取代湿-中生生物群落，但诸如雪刷美洲茶（Ceanothus velutinus）等旱生木本灌木所提供的花粉质量与湿中生林下草本相比是否足以维持传粉者群落，仍属未知。因此，亟需一种高效、客观且能全面反映火后植物-传粉者互作网络的研究手段，以指导火后恢复和生物多样性保护实践。
针对上述问题，研究人员在华盛顿州东部切兰县（Chelan County）的Okanogan-Wenatchee国家森林内，选取了2015年、2018年和2021年三场火烧迹地及一处自1968年以来未火烧的对照区域，建立了九个研究样地。研究于2022年和2023年4月至8月间，每两周部署盆诱器（pan trap）和蓝板诱器（blue vane trap）进行采样，并创新性地从诱器溶液中收集悬浮花粉，结合DNA宏条形码（DNA metabarcoding）技术对花粉样本进行高通量测序，以量化火后不同年限和严重度景观中传粉者群落的觅食资源。研究还同步开展了野外样方调查以比较两种方法的检测效果，并通过广义线性混合模型（GLMM）和指示物种分析（ISA）等方法，系统解析了火烧年限、火烧严重度及植物丰富度对植物和蜜蜂丰富度的影响。
研究结果表明，火烧年限和火烧严重度是火后景观中植物-传粉者群落丰富度的主要驱动因子。植物物种丰富度随火烧年限和火烧严重度的增加而显著增加，且在火烧后4年达到峰值；蜜蜂属丰富度受火烧年限、火烧年限与严重度的交互作用以及植物物种丰富度的显著影响；2023年物种水平的数据进一步证实，蜜蜂物种丰富度与火烧严重度、火烧年限和植物物种丰富度均呈正相关。DNA宏条形码共鉴定出134种虫媒植物，其中菊科（Asteraceae）在样本中出现频率最高，贡献了约四分之一的属和种；欧蓍草（Achillea millefolium）是最常被访问的植物，出现在169个样本中。指示物种分析显示，约22.2%的植物物种与特定火烧年限显著关联，18.5%的植物物种与特定火烧严重度类别显著关联，揭示了火后森林演替过程中植物群落的动态变化。此外，研究还发现，宽松过滤阈值（maxEE=8）比严格阈值（maxEE=2）多鉴定出16种虫媒植物，表明生物信息学阈值选择对植物名录生成具有重要影响。
该研究首次采用测序诱器溶液中悬浮花粉的方法来量化昆虫传粉者的花蜜资源，这一新颖方法充分利用了传统采集过程中的副产物，为火后植物-传粉者互作研究提供了新的技术路径。研究结果强调了维持火烧年限和严重度异质性景观镶嵌体对于保护植物和传粉者多样性的重要性，并为火后恢复中种子混合物的物种选择提供了科学依据，特别是那些在生长季后期仍能提供持续花蜜资源的本土植物种类。
主要技术方法
研究人员在华盛顿州东部切兰县Okanogan-Wenatchee国家森林内，选取了2015年、2018年和2021年三场火烧迹地及一处自1968年以来未火烧的对照区域，共建立九个研究样地。野外采样于2022年和2023年4月至8月间每两周进行一次，部署盆诱器和蓝板诱器采集传粉者，并从诱器溶液中过滤收集悬浮花粉（trap pollen, TP），同时从蜜蜂体表采集花粉（bee pollen, BP）。DNA提取后，以ITS2区域为条形码标记进行PCR扩增，采用Illumina MiSeq平台进行高通量测序。生物信息学分析使用DADA2流程，分别在严格（maxEE=2）和宽松（maxEE=8）两种过滤阈值下生成扩增子序列变异（ASV），并基于切兰县本地植物数据库进行物种注释。统计分析采用广义线性混合模型（GLMM）检验火烧年限、火烧严重度及其交互作用对植物和蜜蜂丰富度的影响，并使用指示物种分析（ISA）识别与特定火烧年限和严重度显著关联的植物物种。
研究结果
严格与宽松DADA2生物信息学过滤阈值的比较
宽松过滤阈值比严格阈值多鉴定出3个科、7个属和16种虫媒植物物种。尽管两种阈值生成的ASV结果均有呈现，后续分析仅采用严格阈值生成的植物物种数据集。
严格过滤阈值（maxEE=2）
经严格过滤后，蜜蜂花粉样本产生194,247条 reads，诱器花粉样本产生924,832条 reads，共鉴定出2171个独特ASV，归属182个物种类别，涵盖44科128属。其中45种疑似风媒污染物种被剔除，最终保留134种虫媒植物，隶属30科95属，其中26种为属级鉴定。菊科（Asteraceae）在280个样本中的238个中出现，贡献了约25%的属和种。欧蓍草（Achillea millefolium）是最常被访问的植物，出现在169个样本中。生长季内超过10%诱器中出现的重要植物物种被按月呈现，指示了传粉者群落的关键花蜜资源。
宽松过滤阈值（maxEE=8）
宽松阈值下共产生997,590条蜜蜂花粉和5,978,556条诱器花粉reads，归入3502个ASV，鉴定出203个物种类别，经剔除后保留150种虫媒植物，隶属33科102属。额外检测到的物种均未在超过4个样本中出现，其中越橘（Vaccinium membranaceum）、绒毛绒籽草（Eriogonum heracleoides）和尖叶斗篷草（Drymocallis arguta）各出现于4个样本中。
DNA与野外数据的比较
野外样方调查鉴定出55种植物和48属，其中21种和35属同时被DNA宏条形码和野外调查检出，分别占DNA检测物种数和属数的15.7%和36.8%。对应分析表明，物种水平84%的变异由采样日期解释，15%由采样方法解释；属水平80.3%的变异由采样日期解释，19.7%由采样方法解释。DNA方法在早春季节检测效果更好，而晚夏季节两种方法的检测结果趋于一致。
植物和蜜蜂物种丰富度的驱动因子
样地水平植物物种丰富度在火烧后4年达到最高（67种），且随火烧年限显著增加（系数=0.120, p<0.001），火烧年限与严重度的交互作用也显著（系数=?0.053, p<0.001）。稀疏化后的蜜蜂属丰富度受火烧年限（系数=?0.096, p<0.001）、火烧年限与严重度交互作用（系数=0.051, p<0.001）以及植物物种丰富度（系数=0.003, p=0.007）的显著影响。2023年物种水平数据显示，蜜蜂物种丰富度随火烧严重度（系数=0.125, p<0.001）、植物物种丰富度（系数=0.016, p<0.001）和火烧年限（系数=0.002, p=0.0002）显著增加。
指示物种分析
约22.2%（24/108）的虫媒植物物种与特定火烧年限显著关联，各火烧年限类别均有对应的指示物种。例如，一年火烧迹地指示物种包括线叶钟穗花（Phacelia linearis）和宽叶柳兰（Chamaenerion latifolium），四年火烧迹地指示物种包括大花 collomia（Collomia grandiflora）和血美洲茶（Ceanothus sanguineus），未火烧区域指示物种包括杰弗里报春（Primula jeffreyi）和全缘向日葵（Helianthella uniflora）。约18.5%（20/108）的植物物种与特定火烧严重度显著关联，低严重度火烧有6种指示植物，中度严重度火烧仅有2种，未火烧区域有10种。
讨论与结论
火烧后植物物种丰富度在4年时达到峰值，此后基本保持稳定，表明开花植物的恢复需要3–4年时间。火烧年限和火烧严重度是植物-传粉者群落丰富度的重要驱动因子，植物丰富度与蜜蜂丰富度呈正相关，支持了以异质性火烧镶嵌体作为火 reintroduction 基本原则的管理理念。研究首次利用诱器溶液中悬浮花粉进行测序来量化传粉者的花蜜资源，这一方法有效利用了传统采集过程中的副产物。菊科植物在样本中出现频率最高，欧蓍草和毛叶钟穗花（Phacelia hastata）等本土多年生草本植物是火后传粉者群落的关键花蜜资源。研究建议管理者在火后恢复中优先选择能够在整个生长季持续提供花蜜资源的本土植物，特别是7月和8月仍能开花的物种，以避免季节性花蜜资源缺口。同时，研究强调了完整区域DNA序列数据库对于准确物种鉴定的重要性，以及维持火烧年限和严重度异质性景观对于保护植物和传粉者多样性的关键作用。
