新喀里多尼亚羽状水螅（feather hydroids）中Ascetosporea多样性及其宿主关联：基于特异性eDNA宏条形码的研究

《Journal of Eukaryotic Microbiology》：Diversity of Ascetosporeans Associated With Feather Hydroids in New Caledonia

　　

Ascetosporea是Endomyxa内的一群寄生性原生生物，主要感染海洋无脊椎动物，并可能对牡蛎和对虾等渔业资源造成严重损害。尽管约50个物种已被正式描述，环境DNA（environmental DNA, eDNA）研究提示其多样性仍被大幅低估，许多谱系尚待发现。其生态作用与宿主范围亦了解不足，部分原因是尚无任何完整生活史得到阐明，这可能与实验室条件下难以维持活细胞有关。在本研究中，研究人员调查了新喀里多尼亚的羽状水螅（feather hydroids）作为Ascetosporea潜在宿主的可能性，该地区此前尚未针对该类群开展检验。研究人员使用Ascetosporea特异性引物进行宏条形码（metabarcoding）分析，从三个水螅个体中检测到46个操作分类单元（operational taxonomic units, OTUs）。其中，31个OTUs归属于环境分支ENDO-3a和ENDO-2，而分别有2个和4个OTUs归属于Paradinida和Haplosporida。值得注意的是，7个OTUs在所有样品中被持续检测到，提示其可能在该环境中与羽状水螅广泛关联。这些发现表明，海洋生态系统中Ascetosporea的多样性与宿主关联被显著低估。

Ascetosporea是Endomyxa（Rhizaria）内的一个纲级分类单元，已正式描述约50种，分属五个目，均为无脊椎动物寄生虫。部分成员可严重损害海洋资源，尤其在养殖环境中，故受到渔业科学关注。在全球气候变化背景下，研究人员担心其对宿主和海洋资源的影响可能加剧。然而，Ascetosporea生物学仍了解不足：分类研究多依赖感染宿主，稳定细胞培养近期才见报道，且尚无任何物种完整生活史被解析。环境DNA（environmental DNA, eDNA）研究提示其多样性被严重低估，海洋环境中许多环境谱系尚未描述；部分Ascetosporea可能生活史中利用多个宿主，包括次级宿主，生态角色可能更广泛复杂。羽状水螅是具羽状分枝的底栖群体水螅，广泛分布于包括深海在内的海洋环境，常形成“动物森林”，提供庇护和基质，作为悬浮摄食者可能参与碳通量与生物泵。然而其寄生虫了解很少；珊瑚作为另一类栖息地形成刺胞动物已知有多种原生生物伴生或寄生，但羽状水螅很少从该角度研究。新喀里多尼亚位于西南太平洋Coral Sea，其面积130万 km²的专属经济区自2014年作为海洋保护区Coral Sea Natural Park管理，但海洋环境受气候变化威胁，生物多样性现状与动态是优先研究。该区域也是深海生物多样性热点，海山物种丰富，最浅海山可能为生物量绿洲和大型移动捕食者庇护所；海山是自然公园关键生态系统，2023年设立Norfolk Ridge自然保护区。区域深海生物多样性仍大部分未探索。2023年起，法国海洋开发研究院（Ifremer）项目ScInObs与JAMSTEC合作部署多学科观测站；首次系泊线于2023年KASEAOPE-1航次在Stylaster海山布放，属Norfolk Ridge。系泊线配备物理传感器和采样器，包括自主礁监测结构（Autonomous Reef Monitoring Structures, ARMS），其原为在珊瑚礁采样隐蔽底栖群落的标准化人工基质。KASEAOPE-2航次回收ARMS，发现其被羽状水螅大量定殖。因此，研究人员以Ascetosporea特异性eDNA宏条形码（metabarcoding）研究羽状水螅作为Ascetosporea潜在宿主。

主要关键技术方法：样本来源为新喀里多尼亚Stylaster海山Northern Slope（Stn. SNS，23°34.956′ S, 167°39.966′ E）系泊线，深度68 m，系泊线总长752 m，2023年5月5日KASEAOPE-1航次布放、2024年10月23日KASEAOPE-2航次回收，船只为R/V Antea；ARMS固定于99%乙醇。关键技术：对顶板随机选取的三个羽状水螅群体提取DNA，扩增18S rRNA基因并亚克隆、Sanger测序进行水螅鉴定，用MAFFT、trimAl、IQ-TREE 3最大似然法（maximum likelihood, ML）和MrBayes贝叶斯法构建系统发育。Ascetosporea检测采用18S rRNA基因V5–V9区嵌套PCR和特异性引物，PacBio Revio测序；QIIME2和DADA2生成扩增子序列变异（amplicon sequence variants, ASVs），VSEARCH以95%相似度重建操作分类单元（operational taxonomic units, OTUs）并去除低丰度序列，BLASTn比对SILVA 136保留Ascetosporea命中，随后作ML和Bayesian分析。

3.1 新喀里多尼亚羽状水螅的分子鉴定（Molecular Identification of Feather Hydroids From New Caledonia）
通过18S rRNA基因克隆测序和系统发育分析，三个样本所得9条克隆序列彼此高度相似（99.50%–100%），形成支持良好的分支。单样本内存在轻微序列变异；不同样本的克隆可完全相同；单核苷酸多态性位于保守和可变区，可能由PCR误差引入。因此三个样本可能属于同一物种。系统发育中，这些序列聚在Zygophylacidae分支内，但支持率中等（65% bootstrap，1.00 Bayesian posterior probability）。仅用core-Macrocolonia序列的额外分析仍未稳健解析其位置；由于仅有三个Zygophylacidae序列可用，且该科已描述70余种、许多分布于深海，新喀里多尼亚深海也有报道，故样本可能属于Zygophylacidae，但仅凭系统发育不能定论，需详细形态学检查；本研究因分类学专长限制未进行形态观察。其位于Macrocolonia的core-Macrocolonia亚支获得强支持，至少表明样本属于Macrocolonia目。因此研究人员暂称其为Macrocolonia sp.。

3.2 新喀里多尼亚Macrocolonia sp.相关Ascetosporea多样性（Diversity of Ascetosporeans Affiliated With Macrocolonia sp. in New Caledonia）
通过Ascetosporea特异性eDNA宏条形码和系统发育分析，从三个Macrocolonia sp.样本中共检测到46条不同的Ascetosporea相关序列（New Caledonia Ascetosporea sequences, NCAs），其中7条在所有样本中持续检测到。稀释曲线达平台，说明测序深度足以捕获主要谱系；No.3原始读长约为其他两样本四倍，但回收的Ascetosporea序列数相近。系统发育恢复主要分支：PARADIN-1、Haplosporida、ENDO-3b、SPP和ENDO-2各自单系，而ENDO-3a未恢复单系；ENDO-3b支持强，PARADIN-1和SPP弱；Haplosporida整体单系支持不足，但其亚支Haplo-B和core-Haplosporida（core-H）强支持。结果提示Haplosporida的界定需重新考虑，并需对其环境分支进行鉴定。PARADIN-1被认为对应Paradinida目，仅含Paradinium属三个种，均为桡足类寄生虫。NCA-6和NCA-28高支持位于PARADIN-1亚支，提示这些序列可能代表与已描述Paradinium不同的生活策略，PARADIN-1宿主范围可能比目前认识更广。NCA-1、-2、-21、-22位于Haplosporida sensu lato；NCA-1和-21强支持归入Haplo-B。Haplo-B此前仅由深海环境序列组成，生物来源不明，这是首次从非深海样本报道Haplo-B序列；若其主要宿主为深海丰富的羽状水螅，可解释该现象。NCA-1在所有样本中检测到，可能主要与Macrocolonia sp.相关。NCA-2和NCA-22形成分支并与Haliotis iris的haplosporidian寄生虫分支相邻，但无统计支持，可能代表Haplosporida和/或paradinids and early diverging Ascetosporea（PEDA）内独立谱系。15条NCAs与ENDO-3a成员相关，ENDO-3a此前无潜在宿主提示，这为鉴定提供线索，部分成员至少与Macrocolonia sp.相关；NCA-3、-4、-23在所有样本中持续检测到，可能主要相关。ENDO-2共检测15条，其中3条在所有样本中持续检测到；近期有两条ENDO-2序列来自xenophyophores宏基因组，但生活方式不清，其宿主也可能多样。PEDA内NCA-9、-29、-33、-42未归入已知分支，位置未完全解析；NCA-9和NCA-33形成高支持分支，但整体支持低，是否属于PEDA仍不确定。另有6条NCAs与一条此前未包含在PEDA中的环境序列MG746635.1形成分支，研究人员将其统称ENDO-AG分支，名称反映其可能与Ascetosporea（A）和Gromiidea（G；Gromia和Filoreta）相关。明确这些谱系的生物身份对理解Ascetosporea多样性和早期演化重要，针对羽状水螅包括Macrocolonia sp.的靶向分析可能是可行途径。

3.3 Ascetosporea多样性与生态意义（Ascetosporean Diversity and Ecological Significance）
通过综合宏条形码、系统发育和生态讨论，研究人员指出羽状水螅虽全球广布包括深海，但其作为Ascetosporea宿主的潜在作用此前未研究。从Macrocolonia sp.检测到46条不同序列且系统发育多样，出乎预期。不能排除部分序列来自感染附着于Macrocolonia sp.的小型生物的寄生虫，但从更广视角可视为与Macrocolonia sp.相关；也可能来自水螅摄食时捕获的环境颗粒或猎物。NCA-3、8、23、31在所有三个样本中持续检测且相对丰度高，提示至少它们与Macrocolonia sp.的关联强于其他检测到的Ascetosporea。既然羽状水螅从未被视为Ascetosporea宿主，需调查其他海洋中其他水螅是否也可作为Ascetosporea宿主。近二十年已表明apicomplexans及其近缘类群与珊瑚相关，因此水螅类也可能广泛与Ascetosporea相关；其他海洋动物也是重要潜在宿主研究对象。还需确定Ascetosporea包括未鉴定谱系如何与宿主发生细胞学关联。已知寄生策略不同：Haplosporidium spp.为组织内寄生（histozoic），Bonamia spp.为细胞内寄生（cytozoic），Paradinium spp.为体腔内寄生（coelozoic）。部分成员可能为共栖或共生。近期对动物宿主相关微真核生物功能的关注增加。新喀里多尼亚检测到的Ascetosporea寄生方式可能多样，生态影响可能因谱系而异；部分可能自由生活或amphizoic。尽管已知Ascetosporea均为无脊椎动物寄生虫，部分可能具有类似diplonemids报道的营养灵活性。该信息对理解其海洋生态角色关键。所用测序方法无法检测Mikrocytida和Paramyxida等分支，因为其18S rRNA基因序列过于分化，所用引物无法扩增；这些类群也具生态重要性，需专门研究，未来应用其他条形码基因。Ascetosporea长期被视为最不了解的原生生物类群之一；但其多样性知识稳步积累，部分谱系培养方法近期已建立。尽管演化和生态角色许多方面未解决，未来十年有望取得重大进展。

研究结论部分翻译：这些发现表明，海洋生态系统中Ascetosporea的多样性与宿主关联被显著低估。Ascetosporea长期被认为是原生生物中了解最少的类群之一。然而，关于其多样性的知识已稳步积累，某些谱系的培养方法近期也已建立。尽管其演化和生态作用的许多方面仍未解决，未来十年有望取得重大进展。