雌性小鼠前腹侧室周区（AVPV）kisspeptin神经元与促性腺激素释放激素（GnRH）神经元的功能互作：激素环境与突触连接调控GnRH神经元放电反应

《Journal of Neuroendocrinology》：Functional interactions between anteroventral periventricular kisspeptin neurons and gonadotropin-releasing hormone neurons in female mice

　　

下丘脑前部的kisspeptin神经元被认为通过引起雌二醇依赖性的促性腺激素释放激素（GnRH）神经元动作电位放电激活及随后的GnRH释放，来启动排卵前GnRH峰。为确定雌二醇或卵巢周期阶段是否调节该环路中的功能连接，研究人员在急性制备的小鼠脑片中光刺激前腹侧室周区（AVPV）kisspeptin神经元，同时记录视前区（POA）GnRH神经元的放电和/或诱发性突触电流。脑片制备于卵巢切除（OVX）后2天及OVX加雌二醇的上午或下午，或间情期、动情前期、OVX后1周的下午，或OVX后6周伴或不伴1周雌二醇替代。光刺激诱导GnRH神经元放电频率持续、频率依赖性增加。这种神经调质典型反应在间情期与动情前期小鼠之间无差异，但在OVX后1周小鼠中减弱，提示卵巢类固醇为维持该反应所必需。在OVX后6周小鼠中，无论是否接受1周雌二醇治疗，神经调质反应均不常见。少数GnRH神经元表现出快速放电频率增加，具有快速突触传递特征。单突触连接在各激素状态间同样较低，并一致为GABA能（GABAergic）。有趣的是，GnRH神经元表现出放电频率增加并不需要快速突触传递证据，提示该系统中神经调质传递可在无快速突触共传递情况下发生。然而，快速突触传递与更大的放电频率增加相关，但仅见于动情前期，表明GnRH神经元对AVPV kisspeptin神经元激活的反应性取决于激素环境和突触连接。

研究背景与问题：促性腺激素释放激素（GnRH）神经元的有节律分泌控制生育，并受卵巢类固醇对下丘脑和垂体的反馈调节。雌性生殖周期大部分时间，雌二醇（E）对GnRH释放发挥负反馈；但在卵泡晚期或啮齿类动情前期，高循环E使反馈由负转正，GnRH释放由脉冲式转为持续数小时的排卵前GnRH峰，继而引起黄体生成素（LH）峰和排卵。GnRH神经元通常不表达雌激素受体α（ERα），而AVPV kisspeptin神经元表达ERα，投射至GnRH神经元并激活之。敲低AVPV区kisspeptin神经元ERα可削弱LH峰，提示AVPV kisspeptin神经元是GnRH峰诱导的关键中介。E可增加AVPV区kisspeptin表达及AVPV kisspeptin神经元动作电位放电率，正反馈时其cFos表达增加。AVPV kisspeptin神经元也表达GABA能标志；GABA_A受体激活可兴奋GnRH神经元，且E诱导和动情前期LH峰期间GnRH神经元接受增强的GABA能传递。问题是，正反馈期间该环路的功能连接是否增加尚不清楚。Krasner、Chen、Moenter、Phillips和Starrett等研究人员利用光遗传学在急性脑片中光刺激AVPV kisspeptin神经元，同时记录POA区GnRH神经元，检测不同激素状态下的功能连接。研究结论为：GnRH神经元对AVPV kisspeptin神经元激活的反应性取决于激素环境和突触连接；神经调质传递常见且不依赖单突触连接；单突触连接低且稳定，并一致为GABA能；动情前期检测到单突触连接的细胞反应更强。其意义在于，AVPV kisspeptin神经元可通过容积传递激活空间上弥散的GnRH网络，卵巢类固醇主要发挥允许作用，而动情前期单突触接触可能使部分GnRH神经元成为峰启动枢纽。

关键技术方法概括：研究人员使用成年雌性（80–185天）GnRH-GFP、Kiss-Cre;Kiss1-hrGFP和Kiss-Cre;GnRH-GFP小鼠，所有程序经University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee批准。在AVPV立体定位注射AAV5-Syn-FLEX-rc[ChrimsonR-tdTomato]，使kisspeptin神经元Cre依赖性表达ChrimsonR。制备急性脑片，进行光刺激并结合靶向细胞外记录、全细胞电流钳和电压钳记录GnRH神经元，部分实验用CNQX、TTX、4-AP、gabazine等药理学鉴定单突触传递和递质；用免疫荧光验证病毒靶向，用PCR检测Kiss1 mRNA。实验队列包括OVX±E、间情期、动情前期、OVX后1周和6周等。

研究结果：
3.1 AAV5递送FLEX ChrimsonR-tdTomato构建体靶向kisspeptin启动子控制Cre重组酶的细胞。免疫荧光显示，AVPV区hrGFP/tdTomato双标细胞分别占hrGFP表达细胞的76.6%和83.3%，<6%的AVPV细胞仅表达tdTomato；弓状核主要为纤维，仅3/772细胞有胞体tdTomato。结论是AAV载体在AVPV kisspeptin神经元中实现Cre依赖性ChrimsonR/tdTomato表达。
3.2 光激活AVPV kisspeptin神经元产生高保真尖峰序列。细胞外记录显示，30个1 ms红脉冲在最高20 Hz时尖峰保真度>95%，≥40 Hz时降低；0.5、1、2 ms脉冲宽度在测试范围内无影响。蓝光可激活ChrimsonR，但15 s持续蓝光前后红光标尖峰保真度无下降。结论是所用光刺激参数可可靠驱动AVPV kisspeptin神经元放电。
3.3 Experiment 1 and 2。每日峰模型OVX或OVX+E小鼠上午和下午制备脑片。血清LH在OVX+E下午未高于上午，且低于OVX，提示E植入未在下午诱导正反馈；子宫质量在OVX+E较高。3.3.1 Experiment 1：全细胞电流钳记录GnRH神经元，生理氯浓度。25个细胞多数无放电，6个细胞刺激后放电增加；24个细胞中仅4个有光诱发突触后电流（ePSC）；放电反应不总与突触检测相关，统计功效不足。3.3.2 Experiment 2：细胞外记录显示，在2 min基线后给予10 Hz 20 s两次和20 Hz 30 s一次刺激，57个刺激列车中18个引起放电增加，大多来自20 Hz；无E或时间效应。全细胞电压钳用等张氯溶液记录53个细胞，突触比例类似。合并Experiment 1和2，突触比例分别为5/24和14/74；E不影响突触比例、成功率、潜伏期或抖动，但增加振幅比。突触存在不能预测放电反应。结论是AVPV kisspeptin至GnRH神经元突触连接率低，E对部分突触电流性质有影响。
3.4 Experiment 3：间情期、动情前期和OVX后1周小鼠对AVPV kisspeptin神经元激活的反应。下午制备脑片，给予5、10、20 Hz、30 s光刺激。动情前期和OVX小鼠血清LH高于间情期，子宫质量动情前期>间情期>OVX，支持动情前期正反馈。增加刺激频率可增加响应细胞比例和放电变化；间情期5 Hz时4/13响应，20 Hz时13/13响应；OVX小鼠频率效应较弱；动情前期20 Hz引起的放电变化大于OVX。高频刺激期间PSC频率和总电荷转移增加，且刺激后大于刺激前，提示局部环路作用持续。结论是GnRH神经元反应呈频率依赖性，并受激素状态调节。
3.5 检测到突触与动情前期细胞放电反应幅度增加相关。对20 Hz刺激足够细胞分析显示，检测到突触的细胞比例<33%，组间无差异；多数放电增加细胞未检测到突触。基线放电率无差异。动情前期检测到突触的细胞，其刺激后放电率和放电变化高于无突触者，也高于间情期或OVX检测到突触者。结论是动情前期单突触连接与更大的GnRH神经元反应相关。
3.6 ePSC为单突触和GABA能。药理学实验中，ePSC被TTX消除并被4-AP恢复，表明为单突触；潜伏期中位数5–6 ms。gabazine阻断ePSC，CNQX不阻断，洗脱后部分恢复。结论是AVPV kisspeptin至GnRH神经元的单突触传递由GABA介导。
3.7 Experiment 4：长期OVX不改变GnRH神经元对光遗传刺激的反应。小鼠病毒注射后1周OVX，5周后给予E或vehicle，1周后记录。PCR显示E增加子宫质量，vehicle组Kiss1 mRNA低于E组。细胞外记录中，OVX组3/9细胞响应，OVX+E组3/10响应，另有1个OVX细胞延迟响应；响应比例、基线放电、刺激后放电和放电变化均无差异。结论是6周OVX及1周E替代未改变GnRH神经元对AVPV kisspeptin神经元激活的反应。
3.8 大多数GnRH神经元在光遗传刺激开始时未表现即时放电增加。总200个细胞中，13个在刺激开始5 s内放电增加>1 Hz；其中10个检测突触的细胞全部有ePSC；73%出现持续增加。结论是即时放电反应罕见，且与单突触输入相关。

讨论总结与研究结论翻译：该研究将GnRH神经元记录与AVPV kisspeptin神经元光刺激结合，发现作用有两种时间尺度：多数细胞在刺激开始后30–90 s出现持续放电增加，少数细胞在刺激开始时快速增加。快速反应与GABA_A受体介导的快速突触传递一致，慢速反应则符合神经调质传递，可能由kisspeptin介导；增加刺激频率可增加反应发生率和幅度。激素状态方面，间情期与动情前期频率-反应关系相似，但OVX后1周反应减弱，提示卵巢类固醇维持神经调质信号模式；6周OVX小鼠反应不常见，且1周E替代未恢复。单突触连接率低且在各激素状态相似，检测到突触并非放电反应所必需，说明kisspeptin可能通过容积传递发挥作用。动情前期，检测到单突触连接的GnRH神经元对AVPV kisspeptin神经元激活表现出更强反应，提示排卵前内分泌环境可增强该环路。局限性包括每日峰模型未检测到预期正反馈、全细胞记录可能漏检远端突触、部分组样本量低等。研究结论翻译如下：AVPV kisspeptin神经元通过两种信号模式激活GnRH神经元：快速突触GABA能传递和可能由kisspeptin介导的慢速神经调质信号。直接突触连接罕见且并非神经调质反应所必需，这一发现表明kisspeptin可通过容积传递发挥作用。因此，尽管单突触连接有限，AVPV kisspeptin神经元仍可激活空间上弥散的GnRH网络，正如对弓状核kisspeptin神经元的提示。卵巢类固醇主要发挥允许作用，维持神经调质信号效能；但在动情前期，接受AVPV kisspeptin神经元单突触信号的GnRH神经元表现出增强的神经调质反应，可能作为峰启动的枢纽。排卵前峰启动可能是多个层面同时变化的结果，包括AVPV kisspeptin神经元群体兴奋性和激活增加、与一部分GnRH神经元功能连接增强、GnRH神经元兴奋性增加、GnRH释放增强及垂体对GnRH敏感性增加。