嗜热古菌PaeASD双突变体R64Q/D350N的晶体结构解析及其催化活性增强机制

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Crystal structure of an activity-enhanced hyperthermophilic quinoprotein aldose sugar dehydrogenase

　　

摘要

嗜热古菌Pyrobaculum aerophilum来源的吡咯并喹啉醌（PQQ）依赖性醛糖脱氢酶（PaeASD），由于其异常高的热稳定性和宽pH范围的适应性，在耐用生物电子设备领域具有巨大潜力。然而，由于该酶催化活性较低，PaeASD固定化电极的电流输出不足，限制了其实际应用。通过定向进化策略获得了一个双突变体（R64Q/D350N），其对葡萄糖的最大反应速率提高了2.4倍，米氏常数（K_m）降低了3.8倍。在本研究中，我们测定了R64Q/D350N在未结合PQQ和结合PQQ两种状态下的晶体结构，以阐明上述增强效应的分子机制。该突变酶与野生型存在显著差异，其中一个环区（N350???R352）远离PQQ结合位点而发生位移。葡萄糖结合模型表明，在野生型酶的活性位点中，R352的大体积侧链位于PQQ的C2羧基和葡萄糖的C3羟基之间，从而限制了葡萄糖的结合。然而，在突变酶中未观察到该位阻屏障。此外，Ca²⁺在突变体的活性位点中被保留，而在野生型中则未被保留。结构比较和定点突变分析表明，R64Q/D350N突变体活性增强和K_m降低可能分别归因于活性位点中Ca²⁺摄入量的增加以及R352位置的显著变化。

要点

• 通过晶体结构分析，阐明了PaeASD的R64Q/D350N突变体活性增强的主要因素

• R352位置的显著改变是K_m值降低的原因

• 活性区域中Ca²⁺摄入量增加有助于V_max值的提高