KT-253：一种高效选择性MDM2蛋白降解剂清除恶性骨髓纤维化干/祖细胞

《Leukemia》：KT-253, a highly potent and selective MDM2 protein degrader, eliminates malignant myelofibrosis stem/progenitor cells

　　

约96%的骨髓纤维化（myelofibrosis，MF）患者表达野生型（wild-type，WT）p53。MF造血干/祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cells，HSPCs）过表达MDM2，后者通过降解WTp53从而支持MF HSPC存活。尽管MDM2小分子抑制剂（small-molecule inhibitors，SMIs）在临床上有效，但其获益因无法充分清除MF HSPCs而受限。KT-253可降解MDM2，并克服使用AMG-232等MDM2 SMI时所观察到的、依赖p53的恢复MDM2水平的反馈环路。研究人员利用MPN细胞系、原发性MF CD34+细胞以及小鼠异种移植模型评估了KT-253的作用。KT-253的活性与p53通路的激活及p53下游基因（包括p21、NOXA和PUMA）的上调相关，这一现象见于WTp53 UKE-1细胞，而p53突变细胞中未见。KT-253处理以比AMG-232低十倍浓度的剂量诱导原发性MF CD34+细胞凋亡，并阻止了AMG-232所观察到的MDM2上调。低剂量KT-253对总MF集落及JAK2V617F+集落数量的减少程度远大于对数级更高剂量的AMG-232（分别为60%和71%对比20%和10%）。小鼠异种移植研究表明，KT-253能更有效地清除JAK2V617F+ MF骨髓再增殖细胞。上述发现支持MDM2降解剂用于MF患者治疗的进一步临床评估。

一、研究背景与意义

骨髓纤维化（myelofibrosis，MF）是一种起源于造血干/祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cells，HSPCs）水平的骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasm，MPN），其发病由JAK2、钙网蛋白或血小板生成素受体MPL等驱动基因突变所致，并常伴随DNMT3A、TET2、ASXL1、SF3B1、SRSF2、U2AF1、IDH1和IDH2等额外髓系恶性肿瘤相关突变。这些突变导致JAK/STAT信号通路持续激活，该通路已成为MF的主要治疗靶点，并促成了四种小分子JAK抑制剂（ruxolitinib、fedratinib、momelotinib和pacritinib）的获批。尽管这些抑制剂的引入在过去十年从根本上改变了MF患者的治疗与预后，但约80%的患者在3年内停用ruxolitinib，停药后中位生存期仅13–16个月。停药原因包括应答不足、骨髓抑制、向MPN原始细胞期转化以及复发或死亡，凸显了针对MF中替代致病通路开发新型疗法的必要性。

由于异基因干细胞移植仍是MF唯一的治愈性疗法，大量研究聚焦于寻找JAK/STAT信号以外失调通路的替代靶向策略，以期开发更有效且耐受性更好的恶性干细胞清除疗法。研究人员此前已证实，无论突变状态如何，MF HSPCs均表现出MDM2表达升高。MDM2是一种E3泛素连接酶，通过促进p53的蛋白酶体降解而负向调控肿瘤抑制因子p53。Nakatake等报道JAK2V617F通过上调La抗原和MDM2蓄积影响p53对DNA损伤的应答，并提示p53功能失活可解释JAK2V617F MPN的细胞因子超敏性，并可能在疾病进展中发挥作用。重要的是，约96%的慢性MPN患者保留WT p53，因此恢复p53活性成为一种有吸引力的治疗策略。

多种靶向MDM2-p53相互作用的小分子抑制剂（SMIs），如Nutlin-3a、RG7388、siremadlin（HDM201）、milademetan、MK-8242和AMG-232（navtemadlin），已被评估用于多种癌症的潜在治疗。研究人员已证明MDM2 SMI可稳定并激活p53，导致MF而非正常HSC的部分清除。后续在MPN患者（真性红细胞增多症和MF）中的临床试验显示血细胞计数、脾脏大小、骨髓纤维化、全身症状改善，以及驱动突变和协同突变的变异等位基因频率（variant allele frequencies，VAF）降低。然而，MDM2 SMI治疗的获益因无法充分清除突变的MF HSPCs而受限。

靶向蛋白降解已成为克服传统方法局限性的有前景的治疗策略。蛋白降解剂利用泛素-蛋白酶体系统消除靶蛋白。KT-253是一种二价MDM2降解剂，招募cereblon E3连接酶复合物使MDM2泛素化并降解，从而破坏MDM2 SMI治疗后导致MDM2重新表达的自身调节反馈环路。与传统SMI不同，KT-253以催化方式促进恶性细胞凋亡，且给药频率更低。KT-253的间歇给药方案可能允许更有效的MF HSPC清除和非恶性细胞恢复，从而可能降低毒性。靶向蛋白降解的临床可行性已由靶向乳腺癌和前列腺癌中雌激素受体和雄激素受体的降解剂的成功所证明。研究人员因此假设KT-253在治疗MF患者方面可能特别有效，因为这些患者的CD34⁺细胞几乎一致地具有WT p53和上调的MDM2蛋白水平，预期KT-253治疗将导致恶性MF HSPCs的更有效清除。

二、主要技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：利用JAK2V617F⁺/p53^WT UKE-1细胞、JAK2V617F⁺/p53^mut SET-2细胞和HEL细胞进行细胞增殖测定和细胞周期分析；采用集落形成实验评估MF患者（n=9）和正常供者（normal donor，ND）CD34⁺细胞（购自AllCells）的造血祖细胞集落形成能力；通过TaqMan SNP基因分型检测JAK2WT和JAK2V617F；利用实时定量逆转录PCR检测p53下游靶基因转录水平；采用Western blot分析MDM2、p53、p21、PUMA、MCL-1和cleaved caspase-3等蛋白表达；使用NOD-NSG-SGM3（NSGS）小鼠（购自Jackson Laboratory）进行骨髓再增殖实验，将经药物预处理的MF CD34⁺细胞移植入亚致死照射的NSGS小鼠，15周后通过流式细胞术分析人源细胞嵌合程度及各谱系细胞比例。患者样本来自MPN研究联盟组织库和西奈山伊坎医学院（ISMMS）血液恶性肿瘤组织库（IRB # 23-00210）。

三、研究结果

1. 1.
   KT-253是一种强效MDM2降解剂，以p53依赖性方式抑制MF细胞生长并诱导凋亡

研究人员将KT-253与AMG-232分别加入JAK2V617F⁺/p53^WT UKE-1细胞、JAK2V617F⁺/p53^mut SET-2细胞和HEL细胞中处理2天和5天。KT-253在降低UKE-1细胞数量方面比AMG-232强10倍以上（2天IC50为74 nM对比740 nM），5天后约强20倍（IC50为31 nM对比730 nM）。细胞周期分析显示KT-253处理UKE-1细胞2天后增加sub-G0/G1期细胞比例并减少S期细胞，而AMG-232需要高得多的剂量才能产生类似效果。KT-253以比AMG-232低10倍的浓度显著诱导UKE-1细胞凋亡。相比之下，KT-253和AMG-232均不能抑制p53突变SET-2或HEL细胞的生长或增加其凋亡程度。Western blot分析显示，KT-253处理0.5小时即耗竭MDM2蛋白水平，而AMG-232在对数级更高剂量下导致MDM2水平在2小时内进行性上调。KT-253在1小时后引起phospho-p53、p53、p21和PUMA水平更大程度升高。此外，两种试剂均降低抗凋亡蛋白MCL-1水平并上调cleaved caspase-3，但所需剂量相差对数级。在SET-2细胞中，KT-253降低了MDM2蛋白水平，但未观察到phospho-p53、p53、p21和PUMA水平的变化。这些发现表明，比AMG-232更低剂量的KT-253影响MPN细胞中WT而非突变p53的功能。

1. 2.
   KT-253通过强效p53通路激活诱导MF CD34⁺细胞凋亡

研究人员用KT-253（10–100 nM）或AMG-232（100–1000 nM）处理9例MF患者CD34⁺细胞48小时。低至10 nM的KT-253即可诱导MF CD34⁺细胞凋亡，而AMG-232浓度高达500 nM仍未能诱导相当水平的凋亡。KT-253（20 nM）处理24小时使p53转录靶标CDKN1A（p21）mRNA水平增加4倍以上，而10倍更高剂量的AMG-232（200 nM）仅引起不到2倍的增加。两种药物均增加BBC3（PUMA）、PMAIP1（NOXA）和BAX转录水平，但降低MCL-1和BCL2L1（BCL-xL）转录水平。Western blot证实KT-253处理后p21蛋白诱导显著更强，即使剂量比AMG-232低10倍。KT-253在2和4小时以比AMG-232低10倍的剂量将cleaved caspase-3和PUMA蛋白水平上调至相似程度。这些数据表明KT-253是一种强效WTp53激活剂，通过快速直接耗竭MDM2蛋白水平，以比AMG-232低10倍的剂量诱导MF CD34⁺细胞凋亡。

1. 3.
   KT-253抑制MF CD34⁺细胞JAK2V617F⁺集落形成

研究人员用KT-253处理9例MF患者的CD34⁺细胞，发现KT-253以剂量依赖性方式减少MF造血集落形成；6.25 nM和12.5 nM的KT-253分别导致造血集落形成减少40%和60%，而相同剂量不影响ND CD34⁺细胞的集落形成潜力。相比之下，对数级更高剂量的AMG-232仅分别导致MF集落数量减少20%和30%。较高剂量的KT-253（而非AMG-232）对ND CD34⁺细胞有毒性作用。此外，KT-253处理MF CD34⁺细胞对JAK2V617F⁺集落数量的减少程度大于对数级更高剂量的AMG-232：12.5 nM KT-253使JAK2V617F⁺集落数量减少71%，而125 nM AMG-232仅使JAK2V617F⁺集落数量减少10%。KT-253处理后JAK2V617F⁺集落减少伴随5例MF病例中4例JAK2 WT集落的持续存在。KT-253对JAK2V617F⁺集落的选择性清除强烈提示存在潜在治疗窗口，可消除恶性MF细胞同时保留非突变CD34⁺细胞。

1. 4.
   KT-253清除骨髓再增殖MF HSC

研究人员使用三转基因NSGS小鼠异种移植模型评估KT-253影响MF JAK2V617F⁺ HSC骨髓再增殖能力的效果。将等数量的来自JAK2V617F⁺ MF患者的CD34⁺细胞用载体、KT-253（25 nM和100 nM）或AMG-232（500 nM）预处理3天。KT-253在25 nM和100 nM浓度下分别使CD34⁺细胞数量减少20%和70%，而AMG-232处理后超过95%的MF CD34⁺细胞持续存在。将剩余细胞移植入NSGS小鼠并维持至15周。移植载体处理MF CD34⁺细胞的小鼠40%和移植AMG-232预处理MF CD34⁺细胞的小鼠20%在第15周前死亡，而移植KT-253预处理CD34⁺细胞的小鼠100%存活。脾脏重量在接受100 nM KT-253预处理细胞的小鼠中显著降低。移植KT-253预处理移植物的小鼠骨髓中人CD45⁺细胞嵌合程度降低程度大于接受更高剂量AMG-232处理移植物的小鼠。骨髓中各人源造血谱系细胞（hCD34⁺、hCD41⁺、hCD33⁺和hCD19⁺细胞）在接受KT-253预处理移植物的小鼠中也显著减少，而AMG-232预处理移植物则未观察到。脾脏中各人源细胞群同样显著减少。重要的是，仅在接受KT-253预处理移植物的小鼠骨髓和脾脏中分离出的hCD45⁺细胞中JAK2V617F⁺ VAF显著降低。形态学分析显示，移植载体或AMG-232预处理细胞的小鼠股骨中造血成分被疏松嗜酸性胶原纤维广泛替代，骨髓纤维化显著增加，而接受KT-253预处理移植物的小鼠中疏松胶原纤维减少。

四、讨论与结论

大多数MF患者保留WT p53，尽管p53功能失活可通过TP53点突变或17p染色体丢失发生。双等位基因TP53丢失在加速期/原始细胞期MPN中更常见（约17%）。在大多数MF患者中，p53活性因MDM2过表达而受到抑制，MDM2已成为治疗MPN患者的有吸引力的药物靶点。MDM2 SMI已被证明可选择性地清除MF HSPC，同时相对保留正常造血。MDM2 SMI治疗的潜在获益已在BOREAS III期研究（NCT03662126）中针对JAK2抑制剂治疗后复发或难治的MF患者进行了测试，该研究比较了navtemadlin（MDM2 SMI，n=123例患者）与最佳可用治疗（best available therapy，BAT，N=60例患者）的疗效。24周后，navtemadlin在脾脏体积减少35%（40%对比20%）和总症状评分改善50%（p=0.05）方面优于BAT。最令人印象深刻的是，48%的navtemadlin治疗患者观察到骨髓纤维化减少，而BAT组为24%。部分分子学应答（MPN驱动突变减少≥50%）发生在18%的navtemadlin治疗患者中，而BAT组为12%。这些数据表明MDM2 SMI在治疗MF方面具有治疗有效性，但可能无法充分清除MF HSPC以改变MF自然病程至异基因干细胞移植所达到的程度。目前navtemadlin正在另一项III期试验POIESIS试验（NCT06479135）中进一步研究。

研究人员试图确定靶向降解MDM2是否优于MDM2 SMI清除MF HSPC，因为降解剂能够克服MDM2 SMI治疗后p53水平升高所触发的、公认的p53依赖性反馈环路，该环路导致MDM2转录增加并限制SMI疗效。一旦MDM2 SMI在MF细胞内代谢清除，MDM2蛋白水平更高，导致活性p53被消耗，可能削弱其临床疗效。此外，正常非造血组织中MDM2的蓄积也可能导致额外的非造血组织毒性。

KT-253产生持续WT p53激活，在降低UKE-1细胞活力方面比AMG-232更有效。这种增强的活性可能反映了PROTAC介导降解的催化和自我强化特性，其中MDM2的持续去除阻止了负反馈环路的恢复并维持持久的促凋亡状态。在原代MF CD34⁺细胞中，KT-253诱导更强的p53通路和p53靶基因（包括p21和PUMA）激活以及cleaved caspase-3表达增加，与10倍更高浓度的AMG-232相比。功能上，纳摩尔浓度的KT-253深刻损害JAK2V617F⁺ MF CD34⁺细胞的集落形成，同时不同程度地保留ND细胞。这种选择性与研究人员之前的观察一致，即MPN HSPCs表现出增加的基线MDM2表达，并依赖MDM2抑制与组成性JAK-STAT信号相关的组成性p53激活。MDM2降解因此优先在突变细胞中暴露p53，导致其凋亡清除。KT-253清除JAK2V617F⁺祖细胞和骨髓再增殖细胞的能力指向潜在的疾病修饰潜力。

由于MF起源于HSC水平，预期需要显著清除这些恶性HSC才能实现持久疾病修饰。研究人员此前评估了候选药物（干扰素-α、imetelstat、MDM2 SMI RG7112，但不包括ruxolitinib）在移植入小鼠异种移植模型前处理这些细胞以清除MF HSC的能力。利用该方法，研究人员证明了MDM2降解剂而非SMI预处理后JAK2V617F⁺祖细胞更大程度减少和功能完整MF干细胞的消除。未进行将人骨髓再增殖细胞移植入二代受体小鼠的实验，因为异种移植研究使用产生人细胞因子的NSGS小鼠，这些细胞因子增加MF细胞嵌合程度但导致能够进行二代移植的HSC分化。该异种移植研究的一个关键局限性是依赖离体药物暴露而非直接体内治疗受体小鼠。该方法不能完全模拟临床环境，其中全身药代动力学、骨髓微环境因素和潜在血液学毒性在决定临床结局中起关键作用。未来利用直接体内治疗剂量的稳健患者来源异种移植（patient-derived xenograft，PDX）模型或同基因JAK2突变小鼠模型的研究对于最终确定KT-253相对于传统MDM2抑制剂的真实体内治疗窗口、全身毒性和突变特异性选择性至关重要。

KT-253治疗潜力的额外支持来自一项涉及复发/难治实体瘤、高危髓系恶性肿瘤和急性淋巴细胞白血病患者的I期试验（NCT05775406）。在该研究中，药物在连续21天周期的第1天单次给药。最常见的不良事件与胃肠道毒性相关，但无中性粒细胞减少或血小板减少证据。值得注意的是，5名接受KT-253治疗的白血病患者中，1名达到完全缓解，1名达到部分缓解。这两名患者患有MPN相关继发性白血病，提供证据表明该药物可能在MPN患者中具有独特疗效。研究人员推测KT-253有效剂量的给药方案可能低于先前临床试验中所采用的方案。支持该方法的是，Chutake等报道单剂量KT-253在急性淋巴细胞白血病异种移植模型中导致持续肿瘤消退。这种间歇给药可能允许正常造血恢复的足够时间，同时维持对MF恶性克隆的累积细胞毒性压力。此外，该给药策略可能限制与MDM2 SMI使用相关的胃肠道毒性。

Adams等此前报道MDM2-PROTAC能够通过激活p73（p53家族成员）消除p53失活的三阴性乳腺癌细胞，但其MDM2 PROTAC对正常人类CD34⁺细胞中的p53或p73及靶基因影响可忽略。研究人员的发现还表明KT-253和AMG-232对正常CD34⁺细胞的影响有限，但两种药物均不能影响p53突变的MPN细胞行为。这种对p53突变细胞缺乏效应与研究人员之前的观察一致，即携带TP53突变的真性红细胞增多症患者对RG7388治疗无应答。研究人员推测Adams报告与研究人员实验室关于MDM2降解剂对p53突变三阴性乳腺癌细胞和MF细胞效应的差异可归因于所用两种降解剂特性的差异，或特定恶性肿瘤中p53家族成员（包括p73，另一种激活p53依赖性促凋亡基因的转录因子，也受MDM2抑制）表达的差异。

总之，这些研究表明使用KT-253降解MDM2代表了一种有前景的替代策略，可重新激活p53并消除TP53-WT MF HSPCs。观察到的体内MF骨髓再增殖细胞消除凸显了KT-253在TP53-WT MF患者中实现真正疾病修饰的潜力。这些发现强烈支持继续MDM2降解剂的临床前和临床开发，作为TP53野生型MF患者可能的变革性治疗策略。