免校准终点吸光度法在PermeaPad?高通量药物渗透筛选中的应用与验证

《Journal of Pharmaceutical Innovation》：Drug Permeation Dataset Across Diverse Chemical Space Using PermeaPad and High-Throughput Plate Reader Assays

中文摘要翻译： 目的：高通量渗透试验是药物发现中识别具有良好渗透性的小分子的重要工具，然而量化其跨仿生膜的转运动力学通常依赖于资源密集型的色谱方法。本研究提出了一种简化的免校准终点吸光度工作流程（POne），用于96孔PermeaPad?格式下的快速渗透性筛选。 方法：在初筛过程中，仅通过单次酶标仪测量并避免化合物特异性校准曲线，研究人员评估了42种化学多样性小分子的渗透性，这些分子被选择用于覆盖与被动膜扩散相关的广泛理化空间。 结果：POne与传统基于校准的UV定量方法（PCal，R2 = 0.85）及LC–MS/MS方法（R2 = 0.82）均表现出强相关性。采用实用的10% POne阈值时，POne与PCal在89%的情况下得出一致的渗透性分类结果，证明了该方法在快速化合物筛选中的实用性。此外，研究人员评估了POne工作流程向黏液偶联渗透模型的转移适用性，以进一步模拟肠道屏障。尽管观察到部分化合物的渗透性受黏液影响而改变，但实验表明，黏液来源的基质干扰限制了直接光学定量，将该方法的适用性限制在具有合适光谱特性的化合物子集内。 结论：尽管发色团结构的需求限制了POne方法的应用范围，但该方法为早期筛选工作流程提供了一种经济高效且稳健的替代方案。 图形摘要：见原文图示。

论文解读文章

一、研究背景与问题

新药开发是一个漫长且昂贵的过程，从药物发现到监管批准往往需要超过十年时间，平均研发成本估计高达20亿美元。在药物开发的早期阶段，高通量筛选（HTS）是识别潜在候选药物的关键步骤之一，而药物渗透性作为决定口服药物吸收和生物利用度的重要性质，其评估在早期筛选中至关重要。口服给药因患者依从性好且成本效益高而成为首选途径，对于口服药物而言，被动跨细胞转运穿过上皮膜是吸收和生物利用度的关键决定因素。因此，体外渗透性评估方法已成为早期药物开发的核心工具，其中无细胞高通量筛选系统因其简单、经济高效且适合大规模化合物筛选而日益受到关注。

然而，尽管96孔板渗透实验可以集成到自动化系统中，渗透化合物的定量分析往往仍是耗时步骤。传统上，渗透性定量依赖于高效液相色谱（HPLC）或HPLC-串联质谱（HPLC–MS/MS）等色谱方法，这些方法虽然准确灵敏，但存在成本高、耗时长、仪器门槛高等问题，与大规模筛选活动中快速决策的需求不相容。此外，在筛选阶段通常只有极少量的化合物可用，最小化包括校准在内的分析消耗至关重要。因此，亟需能够简化和快速评估分子渗透性的分析工作流程。

二、研究内容与意义

针对上述问题，本研究评估了是否可以通过一种简化的、免校准的紫外吸光度方法（基于每个隔室的单次读数，称为P_One）来可靠地估算跨磷脂屏障的渗透性。该研究的创新点不在于使用紫外酶标仪测量本身（这已是成熟技术），而在于开发了一种一步式、免校准的分析工作流程，用于96孔PermeaPad^?格式下的早期化合物筛选。通过避免化合物特异性校准曲线，并将色谱方法仅保留给无法通过吸光度定量的化合物，该方法旨在减少早期筛选中的分析负担和材料消耗。研究的主要目标包括：评估简化紫外读数的可行性和可靠性，以及研究基于被动转运的阈值在早期筛选工作流程中快速分类低/高渗透性化合物的适用性。此外，研究还评估了光学读数向更复杂的仿生黏膜环境转移的可能性，并界定了基质衍生光谱干扰带来的实际限制。

三、关键技术方法

本研究采用PermeaPad^? 96孔板作为仿生磷脂屏障渗透平台。42种测试化合物来源于EU-OPENSCREEN（欧洲非营利性化学生物学与早期药物发现研究基础设施联盟），其中约20%为已批准药物，其余为研究性分子。化合物以10 mM DMSO储备液形式提供，使用Datawarrior软件计算分子描述符。渗透实验在5 mM乙酸铵缓冲液（pH 7.4，含5% DMSO）中进行，供体隔室加入200 μL药物工作溶液（100 μM），受体隔室加入400 μL缓冲液，室温静置孵育5小时。定量方法包括：紫外-可见酶标仪吸光度测量（Thermo Scientific Multiskan SkyHigh，200–700 nm光谱扫描）、四点多浓度校准曲线定量、以及LC–MS/MS（AB Sciex QTRAP 4500，Kinetex Byphenyl色谱柱，正离子电喷雾多反应监测模式）定量。黏液耦合实验使用商业化的SI-Gut³Gel小肠黏液模型。

四、研究结果

数据集描述：研究构建了包含42种化学多样性小分子的数据集，涵盖不同药理学类别和广泛的理化性质范围。约29%的化合物违反至少一项Lipinski或Veber规则，这些化合物通常与较低的渗透性相关。该化学空间的多样性对于在广泛条件下测试简化光学工作流程至关重要。

免校准读数的验证：通过比较P_One与传统校准曲线方法（P_Cal）获得的渗透值，发现两者之间存在强线性相关性（R² = 0.854），表明简化方法能够获得与传统方法相当的渗透估计值。Bland–Altman分析显示P_One存在系统性正偏倚，即相对于P_Cal高估渗透值，且偏差幅度随渗透性增加而增大，这可能归因于缺乏化合物特异性校准以及痕量杂质或光谱重叠的吸光度贡献。尽管如此，大多数数据点落在95%一致性界限内。所有违反Lipinski或Veber规则的分子均表现出低于10%的低渗透百分比。使用咖啡因和四环素作为高渗透性和低渗透性参考化合物的重现性评估显示，咖啡因的运行间变异系数（CV）为3.4%，四环素为19.0%，每次独立运行的平均值均保持了预期的渗透性分类，个体测量水平的分类一致性为95.7%。

与LC–MS/MS的基准比较：以六种参考化合物（咖啡因、环丙沙星、诺氟沙星、普鲁卡因、氨曲南和四环素）为基准，P_One与LC–MS/MS定量结果（P_LC-MS）呈强线性相关（R² = 0.818）。通过回归分析，将先前LC–MS/MS方法中约2%的渗透阈值转换为P_One的等效阈值，约为10%。使用该10%阈值对36种化合物进行二元分类比较，两种定量方法在约89%的情况下给出相同分类结果，不一致的四种化合物均位于阈值边界附近。ROC分析显示AUC为0.891（95% CI: 0.810–0.973, p < 0.0001），进一步确认了简化方法的预测能力。对于缺乏可检测吸光度峰的6种化合物，采用LC–MS/MS MRM模式定量，其中仅Kbio被分类为低渗透性，其余化合物均高于既定阈值。

复杂仿生黏膜屏障的局限性：将SI-Gut³Gel黏液模型耦合至PermeaPad^?系统后，发现黏液基质在低于290 nm波长范围内存在显著的内在吸光度干扰。即使溶解黏液基质并离心去除碎片后，供体样本中仍残留大量黏液材料。因此，在黏液耦合条件下，仅5种吸收峰波长高于300 nm的化合物可进行光学定量。黏液的存在导致LIN、STE、CamK和TOM四种化合物的渗透性显著降低，表明这些化合物与黏液层存在实质性相互作用或被其截留；而HUP的渗透性在有无黏液条件下保持相似。这一发现强调了理解化合物在复杂生理屏障中行为的重要性。

五、讨论与结论

讨论部分指出，P_One的核心贡献不在于绝对定量，而在于快速、免校准的化合物排序。相对于传统UV定量方法，P_One消除了化合物特异性校准曲线，减少了操作时间、消耗品成本和方法开发工作量；相对于LC–MS/MS，P_One以分子选择性和低水平灵敏度换取简单性和可及性。研究选定的实验条件（单一中性pH、5% DMSO）应视为符合目的的筛选工作流程的一部分，而非完全生物相关的肠道吸收模拟。P_One的系统性正偏倚源于其核心假设——吸光度在供体和受体隔室中均可作为质量的代理指标，而无需色谱分离。10%渗透阈值应被视为可转移的概念（严格分诊）而非普遍固定的数值，建议在采用P_One时通过运行小型参考化合物组进行“局部锚定”。由于P_One基于供体和受体吸光度信号计算，其隐含假设可测量的发色团是守恒的，且损失途径不会差异性地扭曲隔室信号；实际筛选中，塑料或膜吸附、沉淀、聚集或化学不稳定性可能违反这一假设，因此建议采用简单的质量控制检查。

研究结论为：P_One是早期阶段化合物渗透性评估的有用工具，具有易用性和节省材料的优势。然而，其本质上比LC–MS/MS的选择性和灵敏度低，因此仅限于在相关浓度下具有足够紫外-可见吸光度的化合物。在本研究涵盖的广泛化学空间中，42种化合物中有36种可成功分析。标准化质量控制和局部阈值锚定对于方法在不同实验室和仪器间的转移至关重要。未来工作将侧重于在仿生介质和不同pH条件下的扩展验证，以及多站点环境下的实验室间可转移性测试。在既定边界内，P_One为加速生物制药导向工作流程中的渗透性筛选、化合物排序和下游验证优先级排序提供了一条务实且经济高效的途径。