哺乳动物代谢工程的高通量散弹式基因组合筛选与复杂合成代谢通路发现

《Nature Biotechnology》：Highly multiplexed mammalian metabolic engineering with a shotgun approach

　　

哺乳动物代谢工程可推动基础生物学、生物制造与细胞治疗发展。然而随着代谢通路复杂度上升，组合设计空间与所需DNA构建体规模迅速扩大，使无偏筛选难以开展。研究人员开发了散弹式基因工程(shotgun genetic engineering, SGE)，利用向哺乳动物细胞递送大量带条形码(barcode)的小构建体而非单个大构建体的优势，使每个细胞成为独立实验，携带探索基因内容、化学计量(stoichiometry)与细胞器定位(organellar localization)的合成通路；通过对呈现目标表型的细胞进行条形码测序，识别功能通路。研究人员利用SGE筛选数百万条通路组合，工程化必需氨基酸(essential amino acid, EAA)生物合成，在中华仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞中实现近乎野生型生长且无缬氨酸(valine)依赖，并赋予异亮氨酸(isoleucine)非依赖生长，在Jurkat细胞中实现缬氨酸非依赖生长。功能通路偏好线粒体定位，并需要数十千碱基合成DNA整合，超出常规筛选规模。所得数据集可支撑机器学习(machine learning, ML)引导的哺乳动物系统复杂生物合成性状解码与工程化。

研究背景方面，对细胞行为实现精确可预测控制是合成生物学核心目标。代谢工程中常通过协调多个转录单元(transcription unit, TU)活动实现控制，TU由基因及其调控元件组成。将外源编码序列(coding sequence, CDS)植入正交宿主可赋予新代谢能力，微生物底盘已有大量成功案例，但哺乳动物细胞因倍增时间长、大DNA递送效率低，通路尺度代谢工程案例很少。设计—构建—测试(design–build–test, DBT)框架在微生物中可快速迭代，在哺乳动物细胞中却受长倍增时间制约；大构建体递送效率随尺寸指数下降，模块化组合策略也只能覆盖约10⁵规模与约10 kb级通路。现有代谢模型多基于自然进化观测数据，难以用于异源或全新TU的生成式设计，因此亟需系统性大规模合成数据。

研究人员开展的研究为提出并验证散弹式基因工程(SGE)：以高复感染复数(multiplicity of infection, MOI)递送池化、单TU条形码库，使每个细胞随机组装独特通路组合，经表型选择后通过条形码测序回溯功能TU组合，从而并行采样百万级代谢通路解。

该研究意义重大在于为哺乳动物细胞通路尺度代谢工程提供可扩展发现框架，并可生成训练预测模型的大规模合成数据集。论文发表于《Nature Biotechnology》。

主要关键技术方法包括：构建含CDS、启动子、细胞器定位信号(organellar localization signal, OLS)的池化TU库并经Golden Gate克隆入慢病毒兼容载体；以慢病毒高MOI感染CHO细胞与Jurkat细胞两类样本队列；用蒙特卡洛(Monte Carlo)模拟按条形码分布与泊松整合估计组合覆盖度；通过氨基酸缺失选择、重氮蓝(resazurin)类代谢活性检测、¹³C同位素标记与质谱、扩增子测序(amplicon-seq)、长读长测序、RNA-seq获得基因型与表型关联；以随机森林(random forest)分类TU组成与表型。

研究结果如下。

设计 of SGE：研究人员设计SGE核心为单个TU比多基因大构建体更易合成、组装和递送；池化条形码TU在高MOI下进入同一细胞，使细胞成为独立实验，可探索通路组成、拷贝数、化学计量与亚细胞定位，再用生长选择或生物传感器等功能读出和条形码测序鉴定富集TU组合。

SGE valine/isoleucine library curation and construction：研究人员构建含ilvN、ilvB、ilvC、ilvD及ilvA、ilvA^L481F、ilvA^L447F、ilvG、ilvM、GFP的10个CDS库，配对EF1a或PGK启动子与有无线粒体靶向序列(mitochondrial targeting sequence, MTS)；扩增子测序显示库内TU分布均衡，慢病毒感染CHO后EF1a相关TU代表性偏低。

Monte Carlo simulation to estimate scale of diversity introduced：研究人员按感染人群条形码分布与泊松整合模拟，MOI 8时可产生约1.56百万不同通路组合，含ilvN、ilvB、ilvC、ilvD四基因的细胞比例足以支持后续选择发现。

Reconstitution and optimization of valine prototrophy in CHO：研究人员对CHO-Div进行低缬氨酸选择，获得克隆在缬氨酸缺失培养基增殖，CHO-Val-D1与CHO-Val-D3倍增时间分别1.14与1.05天，显著优于既往理性设计pMTIV；¹³C标记显示内源缬氨酸合成水平接近丙氨酸内源合成。扩增子与长读长、RNA-seq表明ilvB、ilvC、ilvD在所有原养型克隆存在，ilvN在94%克隆存在；强原养型克隆指纹显示PGK驱动、线粒体的ilvN、ilvB、ilvC、ilvD为主要解，四基因全线粒体定位较随机预期富集48倍。研究人员将SGE启示的线粒体定位四基因通路合成为单构建体并经Flp-In重组送入CHO，缬氨酸缺失下倍增1.25天，优于pMTIV。

Discovery of metabolic pathway solutions to encode isoleucine prototrophy in CHO：研究人员对CHO-Div行低异亮氨酸选择，46克隆中41%改善Ile score；CHO-Ile-10-H1异亮氨酸缺失下倍增1.69天，质谱检测到M+2与M+6异亮氨酸，¹³C标记证明内源合成。强原养型克隆100%含ilvB、ilvC、ilvD、ilvG、ilvM、ilvA^L481F，指纹以PGK驱动线粒体定位为主；六基因全线粒体定位较预期富集217倍，全细胞质定位未出现；营养缺陷型克隆仍富集ilvB、ilvC、ilvD，提示部分通路与中间体共享选择。

Double isoleucine/valine prototrophy in CHO-Val and CHO-Ile clones：研究人员将缬氨酸与异亮氨酸原养克隆置于双缺失培养基，部分克隆达双原养阈值但未达强双原养阈值，说明单性状最优解不等于多性状最优解。

Engineering valine prototrophic human T cells：研究人员以同慢病毒库感染Jurkat细胞，MOI 3.4；模拟显示缬氨酸解可及、异亮氨酸解极稀。低缬氨酸选择后119克隆中71%缬氨酸原养，Jurkat-Val-31与Jurkat-Val-32倍增约2.02与1.87天；低异亮氨酸培养未见选择出原养群体。

Characterization of valine prototrophic human T cell clones：研究人员测序发现Jurkat缬氨酸原养克隆CDS内容与前CHO解一致，偏好PGK驱动线粒体ilvN、ilvB、ilvC、ilvD；存在奠基克隆扩增导致的同胞克隆群，去重后解仍为四基因线粒体定位，较预期富集283倍。

Machine learning to predict prototrophy phenotypes from SGE-generated data：研究人员以克隆级TU读数比例为特征、Val score二分类训练随机森林，四折交叉验证平均准确率0.942、ROC曲线下面积0.993；最重要特征为PGK-MTS的ilvN、ilvC、ilvD、ilvB，与人工解读一致。

讨论部分总结：研究人员指出SGE通过单细胞作为独立实验、随机高拷贝整合单个TU，可高效探索哺乳动物细胞中多TU互作的组合空间，规避大DNA构建体递送瓶颈。该方法可并行组装筛选百万级合成代谢通路，加速发现与优化。EAA原养工程结果显示线粒体区室化是未被充分挖掘的变量；同一库可跨CHO与Jurkat发现收敛设计原则；SGE数据可训练机器学习模型提取生物学意义特征，服务复杂代谢工程。

研究结论部分翻译：研究人员引入SGE，一种在哺乳动物细胞中高效探索由多个互作TU构成的巨大组合设计空间的方法。通过把单细胞作为独立实验并让每个细胞随机高拷贝整合单个TU，SGE实现了数百万合成代谢通路的高通量组装与筛选，绕开了构建和递送大DNA构建体相关的低效率，大幅加速通路发现与优化。利用该方法，研究人员生成并筛选数百万条合成代谢通路，在哺乳动物细胞中工程化EAA原养型：实现缬氨酸缺失培养基中近野生型生长，以及CHO细胞异亮氨酸非依赖生长、Jurkat细胞缬氨酸非依赖生长。功能通路偏好线粒体定位，并要求数十kb合成DNA整合，超越常规筛选规模。该框架还可产出大规模合成数据集，训练机器学习模型进行通路尺度预测与设计，确立SGE作为哺乳动物细胞通路尺度代谢工程的可扩展平台。