ICER调控杏仁核恐惧印记神经元抑制性可塑性决定恐惧记忆精确性的机制

《Neuropsychopharmacology》：ICER-Controlled inhibitory plasticity of amygdala engram neurons regulates fear memory precision

　　

恐惧辨别——区分威胁性刺激与非威胁性刺激的能力——是一种关键的适应性行为，然而个体间在辨别精确性方面存在差异的神经机制仍不清楚。本研究显示，在听觉恐惧条件化后，外侧杏仁核中由小清蛋白阳性中间神经元介导的对恐惧印记神经元的前馈抑制作用选择性增强，这一增强是由印记神经元突触后GABAA受体α1亚基（Gabra1）表达上调所驱动的。在恐惧提取过程中，通过光遗传学或化学遗传学抑制PV-中间神经元活性，或在PV→印记神经元突触处选择性诱导抑制性长时程抑制，均会损害恐惧辨别能力，表现为对新颖音调的僵立反应增加，而对条件刺激的反应不受影响。在机制层面，研究人员发现诱导型cAMP早期阻遏物（ICER）作为一种转录调控因子，通过下调Gabra1表达来限制抑制性可塑性，从而促进恐惧泛化。这些发现确立了一种先前未被认知的抑制性突触可塑性形式，该可塑性控制着恐惧记忆的精确性，并为创伤后应激障碍等疾病中适应不良的恐惧过度泛化提供了潜在的治疗靶点。

研究背景与科学问题

恐惧使动物能够将环境线索与厌恶经历关联起来并对潜在威胁做出反应。在听觉恐惧条件化中，中性听觉条件刺激与足部电击等厌恶刺激配对，导致随后呈现条件刺激时产生包括僵立在内的防御反应。虽然大多数个体能够区分条件刺激与不相似的线索，但有些个体表现出对非威胁性新颖刺激的恐惧泛化。这种变异性凸显了理解维持恐惧记忆精确性的神经机制的必要性。神经印记是学习激活的神经元集群，经历持久的神经可塑性变化以编码记忆。在外侧杏仁核这个恐惧记忆形成的关键脑区，尽管兴奋性突触可塑性在印记神经元中已被确立为恐惧记忆形成和表达的机制，但抑制性突触可塑性在调节印记神经元活性中的作用仍不清楚。新兴证据表明，抑制性环路及其可塑性对于锐化记忆特异性、防止恐惧泛化至关重要。特别是由小清蛋白阳性中间神经元介导的前馈抑制有助于海马体和杏仁核的记忆精确性，而抑制性传递或可塑性的破坏则会促进泛化恐惧。在转录水平，cAMP反应元件结合蛋白调节突触可塑性和印记形成所必需的基因表达，而诱导型cAMP早期阻遏物则拮抗CREB活性并可抑制涉及抑制性可塑性的基因，包括编码GABA_A受体α1亚基的Gabra1。在本研究中，研究人员探究外侧杏仁核中听觉恐惧条件化激活的印记神经元突触可塑性如何促成恐惧辨别。

主要关键技术方法

研究人员使用了多种转基因小鼠品系，包括cFos-tTA、cFos-CreER^T2、PV-Cre、SST-Cre、Grp-Cre及PV-Flp等，结合腺相关病毒载体进行神经元标记和操控。采用离体脑片全细胞膜片钳记录技术测量丘脑诱发的兴奋性和抑制性突触后电流。运用光遗传学和化学遗传学手段分别抑制特定中间神经元亚型。通过免疫荧光和免疫金电子显微镜观察GABA_A受体α1亚基的分布。利用单细胞RNA测序数据分析基因表达变化，并通过K均值聚类对小鼠进行行为分类。

研究结果

PV-FFI向印记神经元的选择性突触后增强

研究人员利用cFos-tTA系统标记听觉恐惧条件化激活的印记神经元。离体电生理记录显示，与非印记神经元相比，印记神经元的微小兴奋性突触后电流事件率更高，同时微小抑制性突触后电流幅度也更大。丘脑刺激诱发的单突触兴奋性突触后电流和双突触抑制性突触后电流在印记神经元中也更强，但抑制/兴奋比在两组间相当。通过光遗传学抑制不同中间神经元亚型发现，PV-中间神经元贡献了最大的前馈抑制份额。在双重转基因小鼠中，PV-前馈抑制在印记神经元中显著大于非印记神经元，而生长抑素阳性中间神经元-前馈抑制则无差异。进一步的光遗传学实验表明，PV-中间神经元介导的抑制性突触后电流的配对脉冲比率在两组间相似，但量子化PV-抑制性突触后电流幅度在印记神经元中更大，频率无差异，提示增强源于突触后机制。

GABA_AR α1介导PV-中间神经元到印记神经元的抑制性传递增强

重新分析已发表的单细胞RNA测序数据发现，在听觉恐惧条件化后2、8、24小时，外侧杏仁核Grp⁺神经元中Gabra1表达显著上调。即时早期基因高表达的Grp⁺神经元（代表印记神经元）比低表达者具有更高的Gabra1表达。免疫荧光和免疫金电镜证实，印记神经元周围GABA_AR α1阳性突触斑点的尺寸和密度均大于非印记神经元，而PV-中间神经元末梢的突触结合蛋白-2标记无差异。

增强的PV-前馈抑制对正常恐惧辨别必不可少

化学遗传学抑制PV-中间神经元而非SST-或胆囊收缩素-中间神经元，损害了恐惧辨别，表现为对新颖音调的僵立增加。光遗传学抑制PV-中间神经元选择性地增加了对远离条件刺激频率的音调的僵立反应。研究人员开发了一种PV抑制性长时程抑郁诱导方案，该方案能选择性地降低印记神经元的PV-抑制性突触后电流。在行为实验中，诱导PV-抑制性长时程抑郁后，小鼠对新颖音调的僵立增加，辨别指数降低，而焦虑样行为和运动能力未受影响。

PV-中间神经元介导的抑制防止印记神经元异常再激活

化学遗传学抑制PV-中间神经元后，暴露于新颖音调的小鼠中c-Fos与印记神经元共标记的比例增加，僵立反应也增强，但暴露于条件刺激时无此效应。总c-Fos阳性神经元数和印记神经元数未改变，排除了印记规模扩大的可能。利用cFos-CreER^T2系统标记音调特异性输入，发现条件刺激特异性输入在印记神经元中诱发成比例增强的兴奋性和抑制性突触后电流，而新颖音调特异性输入则在印记神经元中诱发更强的抑制性突触后电流，导致更高的抑制/兴奋比。

ICER介导的抑制性驱动调控与恐惧泛化

通过K均值聚类将小鼠分为辨别者和泛化者。泛化者的印记神经元周围GABA_AR α1阳性突触斑点的尺寸和密度减小，且缺乏PV-前馈抑制的增强。分子分析显示，泛化者在听觉恐惧条件化后2小时ICER mRNA水平短暂升高，6小时蛋白水平达到峰值，而辨别者保持低水平。在印记神经元中特异性过表达ICER增加了对新颖音调的僵立，降低了辨别指数，并使印记神经元的抑制性突触后电流和抑制/兴奋比下降至非印记神经元水平，同时减少了GABA_AR α1阳性突触斑点和PV-前馈抑制的相对贡献。在ICER过表达的印记神经元中同时过表达Gabra1可恢复恐惧辨别能力。相反，敲降ICER改善了小鼠对新颖音调的辨别。

讨论与结论

本研究的讨论部分指出，研究揭示了恐惧记忆精确性通过外侧杏仁核印记神经元活性的抑制性控制在环路和分子层面的调节机制。首先，听觉恐惧条件化后PV-前馈抑制选择性增强到印记神经元。其次，PV→印记神经元突触处的抑制性可塑性通过α1亚基包含的GABA_AR上调以突触后方式诱导，这支持恐惧辨别。第三，印记神经元中ICER表达升高阻止了这种突触后抑制性可塑性，导致PV-前馈抑制受损和恐惧泛化。研究人员强调，虽然印记神经元兴奋性输入的增强对恐惧记忆提取至关重要，但抑制性输入的作用此前较少被探索。PV-中间神经元作为前馈抑制的主要来源，其作用并非在于调节条件刺激诱发的印记神经元再激活，而是防止新颖刺激引起的异常再激活。这种突触后重塑可能代表了维持兴奋/抑制平衡的稳态适应。ICER通过抑制CREB依赖的Gabra1转录，阻碍PV-中间神经元到印记神经元的抑制性突触成熟。尽管存在基于cFos标记系统的时相精度限制和仅限于小鼠杏仁核机制的局限性，多项独立方法的汇聚提供了因果性证据，表明ICER控制的抑制性可塑性对恐惧记忆精确性具有重要贡献。