时钟基因cycle在生殖活跃的淡色库蚊雌蚊中同步昼夜节律性代谢振荡

《npj Metabolic Health and Disease》：The clock gene cycle synchronizes circadian metabolic oscillations uniquely in reproductively active Culex pipiens females

　　

昼夜节律钟调控每日代谢物丰度的变化，协调动物的活动、摄食与休息。北方家蚊（淡色库蚊，Culex pipiens）还表现出生殖活跃期与越冬滞育（diapause）之间的季节性转换，该转换受日长变化调控。然而，滞育与非滞育状态之间代谢振荡的差异尚未被阐明。研究人员假设，与滞育蚊相比，生殖活跃的非滞育蚊会表现出更大幅度的代谢振荡。此前的研究工作已证明，CYCLE调控胰岛素信号、生殖生长和嗅觉，且敲除cycle基因无论光周期如何都会导致类滞育状态，因此研究人员预测CpCyc?/?蚊的日间和季节性代谢组将出现大规模紊乱。研究人员在非滞育野生型（WT）雌蚊中鉴定出27种呈现高度同步振荡的代谢物，而在WT滞育雌蚊中仅发现11种振荡代谢物。研究人员还观察到，在长日照和短日照条件下饲养的CpCyc?/?雌蚊均出现大规模代谢紊乱，尤其是振荡之间同步性的丧失。这是首次关于淡色库蚊滞育与非滞育个体间振荡代谢物差异以及cycle基因对振荡代谢物影响的报道。该研究为昼夜节律钟如何调控日间和季节性代谢差异提供了额外的机制性见解，对胰岛素失调和代谢紊乱的研究具有启示意义。

论文解读

一、研究背景与科学问题

温带地区生活的昆虫常通过进入滞育这一发育停滞状态来度过冬季等恶劣季节。滞育涉及大规模的代谢变化，包括进入滞育前的脂肪积累以及整体代谢的抑制，从而使昆虫在冬季保存能量资源。在许多昆虫中，滞育与胰岛素信号的抑制密切相关，因此滞育成为理解人类及其他动物中与肥胖、糖尿病和寿命延长相关的代谢变化的极佳研究模型。

光周期是季节变化的一个稳定预测因子，许多昆虫利用昼夜节律钟来检测日长的季节性变化。例如，敲低昼夜节律钟基因cycle会使点蜂缘蝽（Riptortus pedestris）进入类滞育状态，而敲除cycle则阻止家蚕（Bombyx mori）产生滞育卵。此前的比较研究已在麻蝇、寄生蜂、白纹伊蚊、菜粉蝶、棉铃虫、麦红吸浆虫和北方家蚊等多种昆虫中考察了滞育与非滞育个体间的代谢差异。滞育的常见特征包括海藻糖、甘油和/或脯氨酸等冷冻保护物质的上调，以及大多数其他氨基酸的下调。

然而，振荡的昼夜节律代谢组之间的差异研究尚不充分。已有研究在果蝇（D. melanogaster）中发现了34种呈现日间振荡的代谢物，其中7种在转入持续黑暗后仍继续振荡。令人惊讶的是，缺乏功能性时钟的per基因缺失突变果蝇仍表现出14种代谢物的强烈节律性差异，但与野生型不同，这些代谢物以12小时为周期振荡。这些研究表明昆虫中多种代谢物以日为基础振荡，且昼夜节律钟的破坏可导致不良代谢后果。

北方家蚊淡色库蚊的雌蚊传播多种致命病原体，包括西尼罗病毒、圣路易斯脑炎病毒和犬心丝虫。短日照促使雌蚊进入成体滞育，停止寻主和吸血行为，其特征是胰岛素信号抑制和脂肪积累增加，以及日节律活动水平降低，但夜间糖摄食增加。此前的研究发现，敲低时钟基因period、timeless和cryptochrome2可阻止短日照滞育诱导条件下饲养的雌蚊进入滞育，而敲除昼夜节律钟基因cycle则导致70%在长日照条件下饲养的雌蚊进入具有小卵泡的类滞育状态。此外，CYCLE（CYC）蛋白已被鉴定为直接结合调控生殖生长、神经肽信号和嗅觉的基因启动子区E-box元件的核心转录调控因子。

尽管越来越多的证据表明淡色库蚊的昼夜节律钟参与区分长日照和短日照以协调越冬休眠，但目前尚不清楚哪些代谢物在日间或季节条件下振荡，以及时钟的破坏是否会同样改变这些蚊的代谢谱。研究人员假设，非滞育和生殖活跃的蚊比滞育雌蚊具有更多的节律性和振荡代谢物，因为非滞育雌蚊表现出更高和更有节律的运动和摄食活动、更高的代谢率，且此前研究发现滞育雌蚊中与代谢相关的转录本被下调。研究人员还假设，在长日照和短日照条件下饲养的CpCyc^?/?雌蚊都会表现出昼夜节律代谢组的大规模紊乱。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员在长日照（光:暗=16:8小时）和短日照（光:暗=8:16小时）条件下于18°C饲养野生型（WT）和CpCyc^?/?淡色库蚊。蚊虫来源为OSU Buckeye品系作为野生型，cycle^?/?品系由同一实验室品系在先前研究中产生。收集1周龄雌蚊，在ZT01、ZT05、ZT09、ZT13、ZT17和ZT21六个时间点（间隔4小时）进行取样，每个基因型、饲养条件和时间点取8个个体。去除头部后，使用甲醇/氯仿/水体系提取代谢物，水相经蒸发、重悬于含TSP和硼酸的重水中并调至pH 7.4。使用配备低温探针的Ascend 850 MHz谱仪（Bruker BioSpin）采集1D ¹H NOESY谱，并对合并样品采集¹H-¹³C HSQC谱。采用R包mrbin 1.9.4进行谱图分箱（bin宽度0.003 ppm，范围9.5–0.5 ppm），排除残留水信号、提取引入的甲醇和乙醇信号以及蔗糖信号，使用概率商归一化（PQN）校正样品质量和提取效率差异，最终获得161个样品的813个特征（谱箱）数据集。代谢物鉴定使用HMDB和BMRB公共数据库及HSQC谱。数据分析使用R 4.5.2，包括主成分分析（PCA）、一般线性模型（GLM）、通路富集分析、circacompare 0.2.0包进行节律性分析、Rayleigh均匀性检验、相关性网络分析等。

三、研究结果

滞育和CpCyc^?/?蚊的大规模代谢变化**

主成分分析显示WT和CpCyc^?/?蚊在长日照和短日照条件下的整体代谢组谱有相当程度的重叠，但CpCyc^?/?样品可见部分分离，该分离由部分突变个体中肌酸酐、蛋氨酸亚砜和葡萄糖水平升高驱动。一般线性模型分析显示487个和291个谱箱分别随基因型和光周期显著变化，其中分别鉴定出44种和30种与基因型和光周期显著相关的代谢物，包括糖类、氨基酸和B族维生素。与长日照WT相比，短日照滞育WT中葡萄糖、海藻糖及生物素和叶酸等B族维生素平均显著升高，而腺苷一磷酸（AMP）在滞育雌蚊中耗竭。与WT相比，CpCyc^?/?突变体中乙酸、甲酸和丁酸等有机酸，生物素、烟酸和叶酸等B族维生素，海藻糖和果糖等糖类，以及脯氨酸和支链氨基酸异亮氨酸等氨基酸平均显著耗竭；而葡萄糖、肌酸酐及胱氨酸、精氨酸和支链氨基酸缬氨酸显著上调。通路富集分析揭示了ABC转运蛋白、氨酰-tRNA生物合成、FoxO信号通路、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路、磷酸戊糖途径、乙醛酸和二羧酸代谢、氮代谢以及多种氨基酸的生物合成和代谢的变化。

野生型滞育和非滞育雌蚊的昼夜节律代谢物

节律性分析显示，长日照条件下WT蚊中有129个谱箱呈现显著昼夜节律振荡，鉴定为27种独特代谢物。相比之下，短日照滞育条件下仅11种代谢物呈现昼夜节律性（p=0.009），其中仅7种与长日照条件共有。在这7种共有代谢物中，除羟基异己酸外，其余在长日照和短日照之间的振荡峰值时间均存在显著差异。

CpCyc^?/?突变体中振荡模式的破坏

与WT相比，CpCyc^?/?雌蚊在长日照条件下表现出完全不同的节律性模式——WT中27种显著振荡代谢物中有16种在突变体中不再显示昼夜节律活性，其余11种中除羟基异己酸外均表现出节律模式的显著变化。在短日照条件下，CpCyc^?/?雌蚊的振荡代谢物数量反而远高于WT：26种对比11种（p=0.014），其中5种在短日照WT和突变体中均振荡，AMP的模式差异显著。乙酸在长日照和短日照WT中均振荡，但在CpCyc^?/?突变体中未观察到显著振荡。

振荡幅度方面，短日照条件下的中位幅度普遍高于长日照，平均高1.1倍，但仅对CpCyc^?/?突变体显著（校正p=1.3×10^?6）。在长日照条件下，CpCyc^?/?幅度比WT低12.3%（校正p=0.032），而在短日照条件下则增加77.3%（校正p=0.032）。峰值时间分布方面，Rayleigh检验确定WT长日照和CpCyc^?/?长日照的峰值时间呈单峰分布，表明这些条件下大多数振荡代谢物表现出相似模式；WT短日照的均匀性p值为1.2×10^?3，而CpCyc^?/?短日照未达到显著性，表明振荡不同步且峰值时间分散在一天中。WT长日照雌蚊的振荡代谢物丰度在正午前后（中位ZT 6.59小时）呈现狭窄且一致的峰值，而CpCyc^?/?长日照突变体的中位峰值时间接近关灯时间（中位ZT 14.3小时），且分布更宽。短日照条件下WT和CpCyc^?/?的峰值时间均呈宽分布，四分位距在4至16小时之间。CpCyc^?/?短日照条件下葡萄糖和果糖等糖分子呈现振荡行为，而其他组中糖分子未显示昼夜节律模式。

相关性网络分析显示，WT长日照条件下131对代谢物呈显著相关，WT短日照降至44对，CpCyc^?/?长日照为68对，CpCyc^?/?短日照为58对。WT长日照中可见一个包含大多数显著振荡代谢物的大型高度连接簇，包括精氨酸、异亮氨酸和赖氨酸等氨基酸以及叶酸和生物素等B族维生素，呈现高度同步的昼夜节律振荡。另一个由葡萄糖、果糖、葡糖酸和甘油酸等糖类及相关代谢物以及胞苷和核糖-5-磷酸等RNA相关代谢物组成的非振荡正相关簇在WT长日照和短日照中基本一致，表明糖与RNA分子之间的关系是保守的代谢相关簇。然而，长日照中可见的大型振荡氨基酸簇在短日照中被分解为四个较小的簇，表明这些分子不再同步。

四、讨论与结论

研究发现，WT长日照非滞育雌蚊中多种代谢物以高度同步的方式振荡，而WT短日照滞育雌蚊中振荡代谢物较少且振荡大多不同步。cycle基因突变破坏了代谢物的节律性振荡，尤其是在长日照条件下，这与研究人员先前的发现一致，即大多数CpCyc^?/?雌蚊无论长日照还是短日照均处于滞育状态。这是首次报道滞育与非滞育昆虫间振荡代谢物的大规模差异。

WT长日照条件下多种代谢物的中位峰值时间在正午前后，其中乙酰肉碱、赖氨酸和异亮氨酸等代谢物也在果蝇、小鼠和人类中振荡，表明动物日间代谢组存在高度保守性。滞育雌蚊中振荡代谢物数量减少且不同步，可能与非滞育雌蚊在关灯转换时集中糖摄食而滞育雌蚊整夜低水平糖摄食的行为差异有关，也与滞育雌蚊较低的运动节律活性、较高的脂质合成和较低的糖原代谢一致。

CpCyc^?/?突变体在长日照和短日照条件下均表现出非同步振荡，中位峰值时间对应关灯时间，表明其受光照条件直接变化而非昼夜节律钟调控。乙酸在WT中振荡但在突变体中不振荡，结合CYC直接调控对挥发性酸性化合物（包括乙酸）敏感的离子型受体75a样（Ir75a）的发现，表明昼夜节律钟协调内部代谢物丰度与外部感觉感知以调控淡色库蚊特定时间段的寻主和吸血行为。

WT中糖代谢物簇不振荡表明通过胰岛素分泌实现正常的血糖控制，而CpCyc^?/?短日照突变体中该簇出现显著节律性，可能归因于突变体夜间后期糖摄食增加与CYCLE缺失导致的胰岛素信号紊乱。突变体中葡萄糖、肌酸酐和蛋氨酸亚砜（MetSO）水平升高：葡萄糖升高表明CYC缺失导致胰岛素信号抑制，使FoxO转录因子持续激活，驱动向营养储存、脂肪积累和高血糖的滞育特征代谢转换；肌酸酐升高可能与突变体活动模式改变有关；MetSO升高表明其还原为蛋氨酸的水平降低，与FoxO通路变化相关。

通路富集分析揭示CpCyc^?/?突变体中FoxO和mTOR信号通路的重大变化。FoxO此前已被鉴定为淡色库蚊滞育的关键调控因子，mTOR对昼夜节律钟的夹带、同步和自主振荡至关重要。CYC直接调控保幼激素合成刺激因子allatotropin和光周期生殖可塑性调控因子Krüppel homolog 1（Kr-h1），CYC缺失导致这些通路的转录驱动丧失，解释了突变体无法维持非滞育生殖代谢谱而默认进入生殖休眠的原因。

研究人员承认NMR光谱灵敏度相对较低，尤其是处理单个蚊虫的有限样品量时。为保留个体代谢差异，研究人员未采用合并提取物的方法，而是优化了样品制备方案、NMR参数和数据分析流程，并使用高分辨率谱仪。此外，使用去头身体提取物可能混合不同组织和体腔的代谢物，可能平均化并掩盖组织特异性节律模式，未来研究应分离脂肪体、头部或血淋巴等特定组织以精确定位同步振荡发生的位置。

研究还指出，未来比较蚊虫和其他吸血节肢动物吸血前后基因表达和代谢差异的研究，应纳入时间匹配的糖饲个体作为对照，以区分消化脊椎动物血液和卵黄发生特有的差异与自然发生的日间转录和代谢差异。比较滞育和非滞育昆虫的研究也应使用类似的时间匹配对照。

结论：该研究首次报道了滞育与非滞育淡色库蚊之间日间代谢组的差异，发现非滞育生殖活跃雌蚊中大量代谢物以高度协调同步的方式振荡，而滞育雌蚊中大多数这些代谢物不再振荡。cycle基因突变同时破坏了日间和季节性的代谢物水平变化。多种在非滞育WT淡色库蚊中振荡的核心代谢物也在果蝇、小鼠和人类中振荡，凸显了该研究与人类昼夜节律代谢和代谢健康之间的联系。